新型磁感應(yīng)熱療介質(zhì)加熱誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)探究及信號(hào)肽修飾磁性納米介質(zhì)的應(yīng)用.pdf

1、實(shí)驗(yàn)背景:
　　慢性粒細(xì)胞白血病是常見的一種血液系統(tǒng)惡性癌癥，導(dǎo)致其愈后效果不好的一大因素是細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性。目前，尋求新型治療技術(shù)是該疾病治療的重點(diǎn)發(fā)展方向。微納介質(zhì)磁感應(yīng)熱療技術(shù)可應(yīng)用于血液腫瘤治療領(lǐng)域，并且能夠在體外很好的抑制人白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)，但其誘導(dǎo)凋亡產(chǎn)生的作用機(jī)制還不是特別清楚。
　　已知細(xì)胞穿膜肽可以攜帶Fe3O4納米粒子進(jìn)入到細(xì)胞中，而線粒體跟細(xì)胞核又是細(xì)胞中非常重要的兩個(gè)細(xì)胞器，因此我們推測(cè)，將磁性

2、納米粒在線粒體和細(xì)胞核富集有利于增強(qiáng)磁感應(yīng)熱療效果。我們將CPPs穿膜序列與線粒體和細(xì)胞核的定位序列相結(jié)合，設(shè)計(jì)出線粒體和細(xì)胞核靶向定位的多肽序列，引導(dǎo)磁性納米粒在細(xì)胞內(nèi)靶向定位。
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
　　1.探討磁感應(yīng)熱療技術(shù)誘導(dǎo)耐藥白血病K562/G細(xì)胞凋亡的可能性并探討其作用機(jī)制。
　　2.制備信號(hào)肽耦聯(lián)的磁性納米粒并在細(xì)胞水平探究該納米粒應(yīng)用于磁感應(yīng)熱療的安全性和有效性。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　1.應(yīng)用耐

3、藥白血病K562/G細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，以不銹鋼空心球?yàn)榻橘|(zhì)，300kHz，40Gs的磁場(chǎng)條件下43℃熱療30min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率，線粒體內(nèi)膜電位(△Ψm)的變化以及細(xì)胞周期的阻斷情況，探究K562/G死亡是否由凋亡引起;設(shè)置43℃，47℃，50℃對(duì)細(xì)胞進(jìn)行磁感應(yīng)熱療，采用比色法檢測(cè)Caspase-3，8，9的活性;Western blotting分析了Hsp70蛋白及β-catenin蛋白的表達(dá)情況;采用免疫熒光法比較Bax

4、/Bcl-2比值的變化。
　　2.設(shè)計(jì)合成RM，RN，TM以及購(gòu)買魚精蛋白四種信號(hào)肽，共沉淀法合成Fe3O4納米粒，在其表面耦聯(lián)以上四種靶向多肽。采用透射電鏡、傅立葉紅外光譜儀、Zeta電位分析儀進(jìn)行物理表觀的檢測(cè)，并繪制磁滯回線。細(xì)胞與0mg/mL，8mg/mL，16mg/mL，24mg/mL四種濃度的靶向Fe3O4納米粒共孵育，24h后MTT法檢測(cè)合成納米粒的細(xì)胞相容性，使用ICP光譜儀測(cè)定共孵育后細(xì)胞對(duì)納米粒的吞噬情況，共聚

5、焦顯微鏡確定粒子的靶向性，最后MTT法檢測(cè)相同溫度下信號(hào)肽修飾后的納米粒子體外升溫并抑制細(xì)胞增殖的情況。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.35、30、25、20、15mg/mL濃度的不銹鋼空心球在300kHz、40Gs的磁場(chǎng)下溫度升高情況隨濃度而增加。MTT法檢測(cè)空心球24h，48h，72h的細(xì)胞毒性較小，細(xì)胞相容性較好。細(xì)胞在交變磁場(chǎng)下加溫30min，43℃細(xì)胞的增殖率為73.46±2.60％，47℃細(xì)胞的增殖率為66.77±2.

6、34％，50℃細(xì)胞的增殖率為55.66±3.24％，磁感應(yīng)熱療可以很好的殺死以及抑制K562/G細(xì)胞的增殖。流式細(xì)胞儀檢測(cè)43℃磁感應(yīng)熱療30min后，K562/G的凋亡率達(dá)到了39％;線粒體膜電位發(fā)生去極化的細(xì)胞所占的比例由10.2％增加到了70.8％;細(xì)胞的周期被阻斷在G2/M期。磁感應(yīng)熱療后第24h檢測(cè)Caspase3，8，9的酶活均顯著增強(qiáng)，并且隨著加熱溫度的升高，更多的Caspase3，8，9酶原被激活。經(jīng)磁熱療后K562/G

7、細(xì)胞Hsp70蛋白的表達(dá)升高并且隨著熱療溫度的升高表達(dá)增強(qiáng)，而β-catenin蛋白的表達(dá)相應(yīng)降低。免疫熒光檢測(cè)Bax/Bcl-2的比率隨著熱療溫度的增加也逐漸增大。
　　2.使用沉淀法反應(yīng)而成的Fe3O4，其外形近圓球形，直徑大約10nm左右，經(jīng)信號(hào)肽修飾后直徑大小和形態(tài)均保持良好;MTT法檢測(cè)其毒性較小，細(xì)胞相容性好;Zeta電位有所增加;磁飽和度下降;傅立葉紅外光譜儀結(jié)果顯示耦聯(lián)后粒子出現(xiàn)了Fe-O-Fe，Si-O，-CO-

8、NH-收縮震動(dòng)峰，信號(hào)肽成功耦聯(lián)到了磁流體納米粒。ICP檢測(cè)結(jié)果表明耦聯(lián)信號(hào)肽后單個(gè)細(xì)胞中的Fe含量均明顯增加。激光共聚焦觀察帶綠色熒光的Fe3O4磁性納米粒在信號(hào)肽RM，TM的引導(dǎo)下能夠穿過(guò)細(xì)胞膜并在線粒體部位聚集，而RN-MNPs的靶向性不好。SW480細(xì)胞與Fe3O4磁性納米粒子在交變磁場(chǎng)下43℃加溫30min后，耦聯(lián)信號(hào)肽后的納米粒子對(duì)細(xì)胞的熱療效果得到了明顯增強(qiáng)，其中PRO-MNPs對(duì)細(xì)胞的效果最好，細(xì)胞的存活率僅為29.54