納米含砷化合物誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的實驗研究.pdf

1、目的：研究人工合成納米含砷化合物As2S3(直徑<100nm)(以下簡稱As2S3)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞SMMC-7721的增殖抑制、凋亡形態(tài)學(xué)改變及促凋亡作用，為尋求新的肝癌治療策略提供理論依據(jù)。 方法： 1.實驗分三組：As2S3組、As2O3組(用三蒸水稀釋As2O3粉末至所需要的濃度)、空白對照組(加培基)，應(yīng)用血清藥理學(xué)方法通過四甲基偶氮唑藍(lán)比色法(簡稱MTT法)觀察As2S3對肝癌細(xì)胞SMMC-7721體外增殖的抑制

2、作用。As2S3組選取終濃度為1、2、4、8gmol/L四個濃度，分24、48、72小時三個時間點(diǎn)干預(yù)細(xì)胞，篩選As2S3對人肝癌細(xì)胞SMMC-7721增殖抑制的最佳濃度和時間，As2O3組處理方法同As2S3組，空白對照組加培基。常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，進(jìn)入對數(shù)生長期后，貼壁細(xì)胞棄去上清，PBS緩沖液沖洗2遍，用0.25％的胰蛋白酶消化細(xì)胞，用RPMI1640培基調(diào)整細(xì)胞為1×105個細(xì)胞/ml，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔1×104個細(xì)胞/100

3、μl，培養(yǎng)24小時待細(xì)胞貼壁后按實驗分組加入不同濃度藥物，空白對照組加入100μl培基，每組濃度5個重復(fù)孔，放入37℃、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時、48小時、72小時后，每孔加入MTT20μl，再培養(yǎng)4小時，棄上清液，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150μl振蕩溶解10分鐘，待甲瓚完全溶解后進(jìn)行比色，酶標(biāo)儀檢測吸光度(OD)值，波長λ=570nm，計算藥物對腫瘤細(xì)胞的抑制率。計算公式：抑制率(％)=(1-試驗組平均OD值/對照組平均O

4、D值)×100％ 2 采用透射電鏡觀察As2S3作用于人肝癌細(xì)胞SMMC -7721的形態(tài)變化和凋亡情況。根據(jù)MTT實驗結(jié)果，取肝癌細(xì)胞SMMC-7721(5×106/ml)懸液移至無菌細(xì)胞培養(yǎng)瓶，加入終濃度為8μmol/L的As2S3和8μmol/L的As2O3，空白對照組加入培基，置37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)72小時后收集細(xì)胞，經(jīng)2.5％戊二醛溶液前固定，1％鋨酸后固定，逐級酒精脫水，樹脂包埋，超薄切片，經(jīng)醋酸雙氧鈾和檸檬酸

5、鉛雙重染色于透射電鏡(日本日立H-7500型)下觀察凋亡細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化。 3.用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測As2S3作用于人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡率。根據(jù)MTT實驗結(jié)果，用終濃度為81μmol/L的As2S3和8μmol/L的As2O3，空白對照組加培基，作用于肝癌細(xì)胞SMMC-7721，處理72小時后，離心收集細(xì)胞，應(yīng)用PBS液洗滌2次，加入70％乙醇固定，離心去除上清液，加入200μl RNA酶在3

6、7℃處理1小時，然后加800μlPI染色液放置4℃冰箱內(nèi)30分鐘以上，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和凋亡率。 結(jié)果： 1.MTT法結(jié)果顯示2-8μmol/l的As2S3對肝癌細(xì)胞SMMC-7721體外生長有明顯的增殖抑制作用，1μmol/l抑制作用不明顯，抑制率最高的濃度與時間是8μmol/l和72小時，As2O3對肝癌細(xì)胞SMMC-7721體外生長也有明顯的增殖抑制作用，其抑制率最高的是81μMol/L，和72小時，且兩

7、者均有濃度和時間的依賴性，抑制率和濃度與時間成正比，As2S3組的抑制率高于As2O3組和空白對照組(P<0.05)。 2 透射電鏡結(jié)果顯示經(jīng)8μmol/L的As2S3作用72小時的肝癌細(xì)胞SMMC-7721，可看到線粒體的大部分嵴融合或消失，模糊不清，胞質(zhì)內(nèi)可見到滿視野大小不等的空泡典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變，而經(jīng)8μmol/L的As2O3作用72小時的肝癌細(xì)胞SMMC-7721可見到空泡數(shù)量不及As2S3，空白對照組沒有什么變化。

8、 3.流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示經(jīng)8μmol/L的As2S3作用72小時的肝癌細(xì)胞SMMC-7721有明顯的促凋亡作用，凋亡率為18.4％，經(jīng)8μmol/L As2O3作用72小時的肝癌細(xì)胞SMMC-7721的凋亡率是14.4％，空白對照組的凋亡率為2.2％，As2S3組的凋亡率高于As2O3組和空白對照組(P<0.05)。三者細(xì)胞周期比較，As2S3作用72小時肝癌細(xì)胞SMMC-7721的G2/M期細(xì)胞增多，G0/G1期細(xì)胞減少，S期細(xì)胞減