CD44分子抗體在抑制ITP發(fā)病中的作用和機(jī)制研究.pdf

1、原發(fā)免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenia，ITP)，既往稱為特發(fā)性血小板減少性紫癜（idiopathic thrombocytopenic purpura，ITP），是臨床上最常見的免疫性出血性疾病，以外周血中血小板數(shù)目減少為特點(diǎn)，患者體內(nèi)血小板數(shù)減少會(huì)增加出血的風(fēng)險(xiǎn)，輕者可無出血癥狀，嚴(yán)重者可出現(xiàn)月經(jīng)過多、皮膚粘膜出血，甚至內(nèi)臟或顱內(nèi)出血（1-5％患者）危及生命。
　　ITP的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，主要為血

2、小板自身抗體介導(dǎo)的血小板破壞增多。患者自身免疫失耐受，產(chǎn)生了針對(duì)血小板表面糖蛋白(glycoprotein，GP)主要為針對(duì)GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/Ⅸ的自身抗體，此外也有少部分針對(duì)GPⅠa/Ⅱa、GPⅣ、GPⅤ及GPⅥ的抗體，以上自身抗體與血小板表面糖蛋白抗原表位結(jié)合后，抗體的Fc段與網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中組織性巨噬細(xì)胞的FcγRⅡa及FcγRⅢa結(jié)合，介導(dǎo)抗體包被的血小板在脾臟網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中被單核巨噬細(xì)胞識(shí)別、吞噬并破壞，使患者外周血中血小

3、板生存期縮短，數(shù)量減少，導(dǎo)致出血癥狀。其次細(xì)胞毒性T細(xì)胞介導(dǎo)的血小板破壞和巨核細(xì)胞的凋亡異常及成熟障礙導(dǎo)致的血小板生成不足也在部分ITP患者發(fā)病中起重要作用。
　　吞噬作用是先天性和獲得性免疫中的重要組成部分，在抵抗致病菌入侵的第一道防線中起到重要作用，并在維持和調(diào)節(jié)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)中也發(fā)揮作用。吞噬作用失調(diào)不僅僅會(huì)導(dǎo)致宿主細(xì)胞對(duì)致病菌的免疫異常，而且會(huì)導(dǎo)致免疫耐受失調(diào)從而產(chǎn)生慢性炎癥和自身免疫性疾病。吞噬過程可被多種細(xì)胞表面受體誘發(fā)，其

4、中主要有以下兩類:其一為非調(diào)理素受體，此類受體可以直接識(shí)別并與目標(biāo)分子結(jié)合;其二為調(diào)理素受體，調(diào)理素受體可以識(shí)別調(diào)理素分子如抗體、補(bǔ)體。在調(diào)理素受體中，F(xiàn)cγ受體是研究的熱點(diǎn)，它可以與IgG的Fc部分結(jié)合，也可通過結(jié)合補(bǔ)體C3bi部分與補(bǔ)體受體3(CR3)相識(shí)別。
　　目前推薦的ITP一線治療方法包括免疫抑制和免疫調(diào)節(jié)劑(例如:腎上腺皮質(zhì)激素治療、靜脈丙種球蛋白治療(IVIg)和抗-Rh(D)免疫球蛋白治療）。以上三種制劑都可以競

5、爭性結(jié)合單核巨噬細(xì)胞上的Fc受體，阻礙了單核巨噬細(xì)胞與抗體包被的血小板的結(jié)合，防止血小板滯留于脾內(nèi)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，減少單核巨噬細(xì)胞對(duì)血小板的吞噬，并抑制單核巨噬細(xì)胞的趨化作用和遲發(fā)超敏反應(yīng)，改善毛細(xì)血管通透性，緩解出血癥狀。但是上治療可能會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用，如糖皮質(zhì)激素可導(dǎo)致皮質(zhì)功能亢進(jìn)綜合征、骨質(zhì)疏松等副作用。靜脈丙種球蛋白治療雖具有IgG含量高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，患者注射后可使體內(nèi)的IgG水平迅速升高，用藥24h后即可觀察到血小板計(jì)數(shù)上

6、升，約1周左右達(dá)峰值。但患者的治療反應(yīng)是暫時(shí)的，血小板計(jì)數(shù)難以長期維持，在治療3-4周后血小板計(jì)數(shù)即降至治療前水平，極少數(shù)病例可表現(xiàn)為持續(xù)反應(yīng)，導(dǎo)致患者需定期接種、治療費(fèi)用昂貴。對(duì)于以上治療效果欠佳的患者，二線治療措施首選脾切除。本病易反復(fù)發(fā)作、病程長，部分患者對(duì)現(xiàn)有一線、二線治療無效或在短期內(nèi)復(fù)發(fā)，反復(fù)治療遷延不愈發(fā)展為難治性ITP，顯著降低了患者的生存質(zhì)量。
　　CD44分子是一種分布廣泛的細(xì)胞表面黏附分子，可表達(dá)在白細(xì)胞、角

7、質(zhì)形成細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、上皮細(xì)胞和一些內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞。CD44分子可識(shí)別透明質(zhì)酸(HA)和骨橋蛋白，是細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與ECM相互識(shí)別和作用的分子基礎(chǔ)。之前的研究已經(jīng)證實(shí)，CD44分子的激活可以調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。例如，帶有透明質(zhì)酸片段的CD44分子可以誘導(dǎo)多種炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，體外試驗(yàn)也證明CD44分子同時(shí)還可以直接調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞的遷移，此外CD44分子與透明質(zhì)酸分子的相互作用還可以調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的粘附。
　　CD44分子抗體已成功

8、應(yīng)用于多種自身免疫性疾病和炎癥性疾病的動(dòng)物模型，包括實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎、膠原或抗體誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎、自身免疫性糖尿病、實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎、實(shí)驗(yàn)性潰瘍性結(jié)腸炎、實(shí)驗(yàn)性肺嗜酸性粒細(xì)胞增多癥和皮膚遲發(fā)型超敏反應(yīng)等，但其具體作用機(jī)制仍不十分清楚。IM7是一種鼠抗人CD44單克隆抗體，可識(shí)別CD44分子胞外部分，已廣泛應(yīng)用于許多研究，其強(qiáng)大的抗炎作用已經(jīng)在多種疾病模型中被證實(shí)。此外，CD44單克隆抗體KM81，KM201和KM114也被證

9、明在關(guān)節(jié)炎中具有部分抗炎作用。
　　我們之前的研究還發(fā)現(xiàn)CD44單克隆抗體KM114可以明顯改善ITP小鼠模型中SCID小鼠的血小板減少癥狀，對(duì)照組SCID小鼠接受腹腔注射血小板抗體處理后血小板數(shù)量明顯下降，實(shí)驗(yàn)組接受CD44分子抗體KM114和靜脈注射丙種球蛋白(IVIg)預(yù)處理的SCID小鼠體內(nèi)血小板的破壞程度顯著下降，這表明CD44抗體可以在被動(dòng)ITP小鼠模型中與靜脈注射丙種球蛋白(IVIg)起到相似的治療作用，且這種作用不

10、依賴于與B或T細(xì)胞的相互作用。以上研究結(jié)果為ITP的治療提供了新的方向。此外，丙種球蛋白來自于血漿產(chǎn)品，制作成本高、產(chǎn)量有限，臨床使用費(fèi)用昂貴，然而CD44單克隆抗體相比而言，可以節(jié)省成本，也可為患者減少治療費(fèi)用，有重要的研究價(jià)值及前景。
　　在本項(xiàng)研究中，我們利用流式細(xì)胞儀及共聚焦顯微鏡等方法檢測CD44單克隆抗體預(yù)處理對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響，證據(jù)表明，抗CD44單抗IM7、KM114都可以抑制巨噬細(xì)胞FcγR介導(dǎo)的血小板吞噬

11、作用，且相同濃度的IM7相較于KM114而言，對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬作用有更強(qiáng)的抑制作用。此外，數(shù)據(jù)表明CD44分子抗體不影響血小板與巨噬細(xì)胞的結(jié)合，我們推測CD44單抗作用于結(jié)合后的巨噬細(xì)胞內(nèi)吞過程。然而對(duì)于巨噬細(xì)胞FcγR介導(dǎo)的紅細(xì)胞吞噬作用僅IM7可以起到抑制作用。
　　目的:
　　CD44單克隆抗體的廣泛抗炎特性，以及之前研究結(jié)果表明KM114等CD44單克隆抗體可以在ITP小鼠模型中起到治療作用促使我們想要探究它是否能抑制

12、巨噬細(xì)胞的吞噬功能。利用抗體包被/未包被的紅細(xì)胞/血小板與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，檢測巨噬細(xì)胞的吞噬作用，在體外模擬ITP的主要發(fā)病機(jī)制;將經(jīng)過CD44抗體預(yù)處理的巨噬細(xì)胞與抗體包被的紅細(xì)胞/血小板共培養(yǎng)，檢測不同表型及不同濃度的CD44單克隆抗體對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬作用的影響，并分析其與抗體表型及濃度的關(guān)系;檢測不同表型及不同濃度的CD44單克隆抗體與巨噬細(xì)胞表面CD44分子的結(jié)合能力，明確CD44單克隆抗體作用產(chǎn)生的具體機(jī)制。
　　方法:<

13、br>　　1.培養(yǎng)RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞、THP-1人白血病單核細(xì)胞系。
　　2.用PMA刺激THP-1細(xì)胞過夜，使之進(jìn)一步分化為巨噬細(xì)胞。
　　3.收取CD1野生型雌性小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞，培養(yǎng)得原代小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。
　　4.收取CD1野生型雌性小鼠的外周血，Coulter counter計(jì)數(shù)血小板數(shù)目、Grava流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)紅細(xì)胞數(shù)目，離心獲取紅細(xì)胞及血小板。
　　5.用Ter-119及Mwreg30

14、等抗體包被紅細(xì)胞/血小板，將抗體包被的紅細(xì)胞/血小板與小鼠巨噬細(xì)胞在37。C共培養(yǎng)30分鐘。
　　6.倒置顯微鏡檢測巨噬細(xì)胞內(nèi)吞的紅細(xì)胞數(shù)目，在顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)200-300個(gè)巨噬細(xì)胞，計(jì)算巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)(PI)，即PI=被內(nèi)吞的所有紅細(xì)胞數(shù)/巨噬細(xì)胞總數(shù)×100。
　　7.流式細(xì)胞術(shù)檢測巨噬細(xì)胞內(nèi)血小板的含量，即以CMFDA標(biāo)記血小板，以CMFDA的平均熒光強(qiáng)度來反應(yīng)巨噬細(xì)胞對(duì)抗體包被的血小板的吞噬指數(shù)。
　　8.

15、巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn)檢測CD44分子抗體對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響。即以CD44單克隆抗體KM114/IM7預(yù)處理巨噬細(xì)胞，并將抗體包被的紅細(xì)胞/血小板與小鼠巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)30分鐘。
　　9.熒光共聚焦顯微鏡檢測小鼠腹腔巨噬細(xì)胞對(duì)抗體包被的山羊紅細(xì)胞的吞噬指數(shù)，即預(yù)先以CMFDA標(biāo)記紅細(xì)胞，待與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后，以AlexaFluor-643標(biāo)記的兔抗羊二抗標(biāo)記巨噬細(xì)胞外的紅細(xì)胞，以Alexa Fluor-555標(biāo)記的麥芽胚凝集素染色巨

16、噬細(xì)胞膜，在顯微鏡下分別計(jì)數(shù)200-300個(gè)巨噬細(xì)胞內(nèi)的紅細(xì)胞，計(jì)算巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)（PI=巨噬細(xì)胞內(nèi)吞的紅細(xì)胞數(shù)/巨噬細(xì)胞總數(shù)×100）。
　　10.熒光共聚焦顯微鏡檢測巨噬細(xì)胞對(duì)血小板的吞噬指數(shù)及結(jié)合指數(shù)，即預(yù)先以CMFDA標(biāo)記血小板，待與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后，以Alexa Fluor-647標(biāo)記的羊抗鼠二抗標(biāo)記巨噬細(xì)胞外的血小板，在顯微鏡下分別計(jì)數(shù)200-300個(gè)巨噬細(xì)胞內(nèi)/外的血小板，計(jì)算巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)（PI=巨噬細(xì)胞內(nèi)吞的

17、血小板數(shù)/巨噬細(xì)胞總數(shù)×100）。同時(shí)計(jì)算血小板與巨噬細(xì)胞的結(jié)合指數(shù)（BI=結(jié)合在巨噬細(xì)胞表面的血小板數(shù)/巨噬細(xì)胞總數(shù)×100）。
　　11.CD44分子抗體結(jié)合實(shí)驗(yàn)，檢測CD44分子抗體與巨噬細(xì)胞的結(jié)合能力。即以CD44單克隆抗體KM114/IM7預(yù)處理巨噬細(xì)胞，以PE標(biāo)記的羊抗鼠二抗標(biāo)記巨噬細(xì)胞表面結(jié)合的CD44分子抗體，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測，以PE的平均熒光強(qiáng)度來反映CD44分子抗體與巨噬細(xì)胞的結(jié)合能力。
　　結(jié)果:

18、r>　　1.抗體包被后的紅細(xì)胞/血小板可以被巨噬細(xì)胞識(shí)別并吞噬。用抗體TER-119包被的小鼠外周血紅細(xì)胞的吞噬指數(shù)（RAW264.7細(xì)胞PI=157.2; THP-1細(xì)胞PI=89.63），明顯高于未處理組P＜0.0001（RAW264.7細(xì)胞PI=0;THP-1細(xì)胞PI=0.49），并且流式細(xì)胞儀檢測得與Mwreg30抗體包被的血小板共培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度明顯高于未處理組(1849 vs458，P＜0.001)。
　　

19、2.檢測IM7/KM114預(yù)處理后巨噬細(xì)胞對(duì)TER-119包被的小鼠紅細(xì)胞的吞噬作用。結(jié)果表明，在RAW264.7及THP-1分化的巨噬細(xì)胞中，對(duì)照組(PI=157.2、89.63)，IM70.1ug/ml時(shí)吞噬指數(shù)(PI)分別為157.2、30.49;1μg/ml、10μg/ml時(shí)PI為0，與對(duì)照組有明顯差異(P＜0.0002)，并且這種抑制作用表現(xiàn)為劑量依賴性。然而KM114預(yù)處理對(duì)兩種巨噬細(xì)胞對(duì)小鼠紅細(xì)胞的吞噬功能沒有影響（KM1

20、1410μg/ml時(shí)PI=139.47、64.2，P＞0.55）。
　　3.CD44分子抗體可以抑制巨噬細(xì)胞對(duì)血小板的吞噬作用，當(dāng)IM7濃度為0.1μg/ml時(shí)，對(duì)巨噬細(xì)胞的吞噬作用表現(xiàn)為部分抑制作用(P＜0.001);當(dāng)IM7濃度為1μ g/ml時(shí)即可達(dá)到幾乎完全抑制作用(P＜0.0001)。當(dāng)KM114濃度為0.1μg/ml時(shí)，可起到輕微抑制作用(P＜0.001);當(dāng)KM114濃度為1μg/ml、10μg/ml時(shí)，表現(xiàn)為對(duì)吞噬

21、作用部分抑制作用(P＜0.0001)。相同濃度的IM7的抑制作用強(qiáng)于KM114(P＜0.02)。KM11410μg/ml時(shí)與IM71μg/ml表現(xiàn)為相同程度的抑制能力(P=0.71)。
　　4.CD44分子抗體不影響巨噬細(xì)胞與血小板的結(jié)合。兩種同型對(duì)照及低濃度CD44單抗處理后，血小板結(jié)合指數(shù)與對(duì)照組相比均無明顯差異(P＞0.5)。僅在IM7高濃度時(shí)(1μg/ml、10μg/ml)表現(xiàn)為巨噬細(xì)胞表面結(jié)合的血小板增多。
　　5

22、.CD44分子抗體IM7與巨噬細(xì)胞的結(jié)合率大于KM114。RAW264.7巨噬細(xì)胞中，IM7在濃度為5μg/ml即可達(dá)到90％結(jié)合率;同濃度的IM7與KM114相比，IM7與巨噬細(xì)胞的結(jié)合率明顯高于KM114(P＜0.001)。其中KM11410μg/ml與IM71μg/ml表現(xiàn)為相似的與巨噬細(xì)胞的結(jié)合率(P＞0.5)。KM114在濃度為0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml時(shí)與同型對(duì)照無顯著性差異(P＞0.5)，在濃度為5μ

23、g/ml時(shí)，結(jié)合率為95.4％明顯高于未處理組(P＜0.008)。THP-1細(xì)胞中，IM7可以與THP-1細(xì)胞表面的CD44分子結(jié)合，當(dāng)IM7濃度為0.1μg/ml時(shí)與對(duì)照組無顯著性差異(P=0.36)，在濃度為10μg/ml即可達(dá)到90％結(jié)合率(P＜0.0002)。然而在所有KM114處理組中均與未處理組無明顯差異(P＞0.5)，表明KM114分子無法與THP-1細(xì)胞表面的CD44分子結(jié)合。
　　結(jié)論:
　　1.抗體包被后

24、的紅細(xì)胞/血小板可以被巨噬細(xì)胞識(shí)別并吞噬，可以在體外模擬ITP的發(fā)病機(jī)制。
　　2.IM7預(yù)處理可以抑制抗體介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞對(duì)紅細(xì)胞的吞噬作用，并且這種抑制作用表現(xiàn)為劑量依賴性。然而KM114預(yù)處理對(duì)巨噬細(xì)胞對(duì)小鼠紅細(xì)胞的吞噬功能沒有影響。
　　3.IM7和KM114對(duì)抗體介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞對(duì)血小板的吞噬作用均有抑制作用，并呈現(xiàn)出劑量依賴性，且相同濃度的KM114與IM7相比抑制作用稍弱。說明CD44單克隆抗體可以作為治療ITP的