RNASET2分子在白癜風(fēng)發(fā)病中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾方面進(jìn)行了論述：
　　第一部分 應(yīng)激對(duì)人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞和黑素細(xì)胞RNASET2的表達(dá)影響
　　目的:探討白癜風(fēng)患者皮損區(qū)RNASET2的表達(dá)情況;運(yùn)用改良方法，簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)地從人包皮組織中分離擴(kuò)增得到大量高純度原代角質(zhì)形成細(xì)胞(HEKs)和黑素細(xì)胞(HEMs);在體外觀察應(yīng)激因素作用下HEKs和HEMs中RNASET2的表達(dá)情況。
　　方法:利用實(shí)時(shí)PCR和Western blot分析了白癜風(fēng)皮損處RN

2、ASET2的表達(dá)，并用RNASET2的多克隆抗體進(jìn)行免疫組化研究，以確定白癜風(fēng)樣品中RNASET2表達(dá)情況;根據(jù)原代角質(zhì)形成細(xì)胞和黑素細(xì)胞對(duì)胰酶的不同耐受性和成纖維細(xì)胞不能耐受G418的特性可分離出純?cè)谒丶?xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞;過(guò)量的紫外線照射(NB-UVB)、氧化應(yīng)激(H2O2)、炎癥(LPS)刺激體外培養(yǎng)的HEKs和HEMs，利用實(shí)時(shí)PCR，Western blot和免疫熒光檢測(cè)技術(shù)鑒定HEKs和HEMs在應(yīng)激作用下RNASET2表達(dá)情

3、況。
　　結(jié)果:與正常對(duì)照組相比較，白癜風(fēng)患者皮損RNASET2在轉(zhuǎn)錄（白癜風(fēng)vs對(duì)照組:4.056±1.115 vs1.034±0.166; p＜0.001）和蛋白水平都顯著升高;成功從人包皮組織中分離擴(kuò)增得到大量高純度HEKs和HEMs;與未處理組比較，HEKs和HEMs在一定應(yīng)激作用劑量范圍內(nèi)，RNASET2在轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平都有明顯升高。
　　結(jié)論:白癜風(fēng)患者皮損處RNASET2顯著增加;白癜風(fēng)誘發(fā)因素可以使HEK

4、s和HEMs中RNASET2表達(dá)增加。
　　第二部分 RNASET2基因產(chǎn)物對(duì)原代角質(zhì)形成細(xì)胞和黑素細(xì)胞生物學(xué)功能的影響
　　目的:探討體外RNASET2過(guò)表達(dá)對(duì)原代培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞和黑素細(xì)胞的生物學(xué)功能影響。
　　方法:利用RNASET2過(guò)表達(dá)慢病毒分別感染原代角質(zhì)形成細(xì)胞和黑素細(xì)胞;感染后72h，用熒光顯微鏡觀察鑒定了慢病毒感染細(xì)胞的效率;通過(guò)Western blot技術(shù)對(duì)感染結(jié)果進(jìn)行了鑒定;采用CCK-8細(xì)胞活

5、性實(shí)驗(yàn)、Annexin V-APC/7-AAD雙色標(biāo)記法和colony-forming法對(duì)RNASET2過(guò)表達(dá)原代角質(zhì)形成細(xì)胞和黑素細(xì)胞的增殖凋亡情況進(jìn)行了研究;通過(guò)將適當(dāng)濃度的外源性氧化應(yīng)激因素H2O2加入RNASET2過(guò)表達(dá)的原代角質(zhì)形成細(xì)胞和黑素細(xì)胞中，觀察氧化應(yīng)激對(duì)RNASET2過(guò)表達(dá)細(xì)胞的影響;采用實(shí)時(shí)PCR、Western blot、黑素含量測(cè)定以及酪氨酸酶活性測(cè)定等技術(shù)檢測(cè)RNASET2過(guò)表達(dá)對(duì)黑素細(xì)胞合成黑素能力的影響情

6、況。
　　結(jié)果:慢病毒成功感染原代角質(zhì)形成細(xì)胞和黑素細(xì)胞72h后，感染效率＞90％;與轉(zhuǎn)染空載體(VECTOR)細(xì)胞比較，RNASET2過(guò)表達(dá)(OE RNASET2)引起原代角質(zhì)形成細(xì)胞(VECTOR vs OE RNASET2:4.167±0.330 vs23.467±1.482;p=0.003)和黑素細(xì)胞(VECTOR vs OE RNASET2:5.400±0.455 vs27.333±1.053;p=0.001)的凋亡具有

7、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;RNASET2過(guò)表達(dá)使原代角質(zhì)形成細(xì)胞和黑素細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激更敏感;RNASET2過(guò)表達(dá)導(dǎo)致黑素細(xì)胞合成黑素能力下降。
　　結(jié)論:RNASET2過(guò)表達(dá)導(dǎo)致原代角質(zhì)形成細(xì)胞和黑素細(xì)胞凋亡;RNASET2過(guò)表達(dá)導(dǎo)致黑素細(xì)胞合成黑素能力下降。
　　第三部分 RNASET2基因產(chǎn)物在白癜風(fēng)發(fā)病中的機(jī)制研究
　　目的:探討RNASET2過(guò)表達(dá)導(dǎo)致原代角質(zhì)形成細(xì)胞和黑素細(xì)胞凋亡和黑素合成下降引發(fā)白癜風(fēng)的機(jī)制。
　　

8、方法:為探討RNASET2的促凋亡作用是否依賴于其催化位點(diǎn)，采用RNASET2催化位點(diǎn)突變后的過(guò)表達(dá)慢病毒(OE RNASET2-ci)分別轉(zhuǎn)染原代角質(zhì)形成細(xì)胞和黑素細(xì)胞;同時(shí)，由于最近研究發(fā)現(xiàn)RNASET2的結(jié)構(gòu)中含有能結(jié)合凋亡因子TRAF2的結(jié)構(gòu)域，為證實(shí)RNASET2分子中TRAF2結(jié)構(gòu)域是否與RNASET2的促凋亡作用相關(guān)，我們將RNASET2的TRAF2結(jié)合位點(diǎn)突變后的過(guò)表達(dá)慢病毒(OE RNASET2-ti)分別轉(zhuǎn)染原代角質(zhì)

9、形成細(xì)胞和黑素細(xì)胞;用熒光顯微鏡觀察鑒定了慢病毒感染細(xì)胞的效率;通過(guò)Western blot技術(shù)對(duì)感染結(jié)果進(jìn)行了鑒定;采用CCK-8細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)和Annexin V-APC/7-AAD雙色標(biāo)記法對(duì)RNASET2過(guò)表達(dá)原代角質(zhì)形成細(xì)胞和黑素細(xì)胞的增殖凋亡情況進(jìn)行了研究;為探討RNASET2的促凋亡作用依賴于RNASET2蛋白與TRAF2蛋白的相互結(jié)合作用，采用免疫共沉淀(CO-IP)及Western blot技術(shù)檢測(cè)RNASET2突變前后

10、過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響情況。
　　結(jié)果:RNASET2催化位點(diǎn)突變后的過(guò)表達(dá)慢病毒(OE RNASET2-ci)和RNASET2的TRAF2結(jié)合位點(diǎn)突變后的過(guò)表達(dá)慢病毒(OE RNASET2-ti)分別成功感染原代角質(zhì)形成細(xì)胞和黑素細(xì)胞，感染效率＞90％; RNASET2基因產(chǎn)物導(dǎo)致細(xì)胞凋亡不依賴于其催化位點(diǎn)，而是與凋亡因子TRAF2密切相關(guān);RNASET2通過(guò)RNASET2-TRAF2-caspases通路引起細(xì)胞凋亡。