CD38分子在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的表達(dá)和作用機(jī)制研究.pdf

1、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以慢性侵襲性滑膜炎癥和骨質(zhì)破壞為臨床特征的自身免疫性疾病。患病人數(shù)占世界人口的0.5％～1.0％，在我國(guó)的患病率約為0.32％～0.36％。在RA的自然病程中，其致殘率高達(dá)15％，成為威脅人類健康的殺手。因此早期診斷和治療至關(guān)重要。
　　跨膜糖蛋白CD38分子廣泛表達(dá)于淋巴細(xì)胞，既是細(xì)胞表面受體又具有酶活性，可以催化環(huán)二磷酸腺苷核糖(cyclic adenosin

2、e diphosphate ribose，cADP)和煙酸腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate，NAADP)兩種鈣信使物質(zhì)的代謝，參與胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞增殖與凋亡、分化成熟和遷移，是淋巴細(xì)胞活化的表面標(biāo)記。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，CD38分子功能的喪失與固有和適應(yīng)性免疫應(yīng)答改變和損傷密切相關(guān)，參與了多種自身免疫性疾病的發(fā)病過(guò)程。
　　為進(jìn)一步闡明CD38分子

3、是否通過(guò)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)參與RA發(fā)病，本課題通過(guò)臨床和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究CD38分子在RA患者外周血淋巴細(xì)胞亞群的分布和其調(diào)節(jié)機(jī)制，為以CD38分子作為靶點(diǎn)的小分子化合物治療提供理論依據(jù)。
　　第一部分
　　目的:
　　研究CD38在RA患者體內(nèi)不同淋巴細(xì)胞亞群中的表達(dá)差異及RA外周血淋巴細(xì)胞CD38表達(dá)水平的影響因素;RA患者不同淋巴細(xì)胞亞群分布格局和激活狀態(tài)，著重研究RA外周血NK細(xì)胞數(shù)量和表型變化。
　　方法:<

4、br>　　隨機(jī)選取RA患者139例為病例組，年齡、性別匹配的正常健康人群120例為健康對(duì)照組。詳細(xì)采集患者人口學(xué)特征（性別、年齡）、病程、關(guān)節(jié)腫脹數(shù)(SJC)、關(guān)節(jié)壓痛數(shù)(TJC)、VAS評(píng)分、類風(fēng)濕因子(RF)、抗環(huán)瓜氨酸肽抗體(anti-CCP)、血沉(ESR)、C反應(yīng)蛋白（CRP）、計(jì)算疾病活動(dòng)指數(shù)(DAS28-CRP)，關(guān)節(jié)骨侵蝕分級(jí)。采用多色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NK(CD3-CD56+)細(xì)胞、T(CD3+)、B(CD19+)淋巴細(xì)胞

5、比例和CD38陽(yáng)性NK、T、B(CD19+)淋巴細(xì)胞比例。一般線性模型分析影響RA外周血NK細(xì)胞比例的相關(guān)因素。Pearson和Spearman等級(jí)相關(guān)分析CD38陽(yáng)性總淋巴細(xì)胞比例與臨床指標(biāo)間的相關(guān)關(guān)系。線性相關(guān)分析CD38陽(yáng)性總淋巴細(xì)胞比例與疾病活動(dòng)性指標(biāo)CRP、DAS28-CRP的相關(guān)系數(shù)。
　　結(jié)果:
　　1.RA患者外周血T淋巴細(xì)胞(CD3+)和輔助/誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞(Th細(xì)胞CD3+CD4+)比例高于健康對(duì)照組，兩

6、組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.0065;P=0.0038)。抑制/細(xì)胞毒T細(xì)胞（Ts細(xì)胞CD3+CD8+）和B淋巴細(xì)胞(CD19+)比例兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.613;P=0.587)。RA患者NK細(xì)胞(CD3-CD56+)占淋巴細(xì)胞的比例低于健康對(duì)照組，兩組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.033)。中高度活動(dòng)組RA患者NK細(xì)胞在外周血的下降尤為顯著?；颊咄庵苎狢D38+總淋巴細(xì)胞比例顯著高于健康對(duì)照組(P=1.91E-09)。CD38分子在

7、Th淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞表達(dá)均顯著高于健康對(duì)照組(P值均小于0.05)，而CD38+B淋巴細(xì)胞和CD38+Ts細(xì)胞比例在RA和健康人群兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P值均大于0.05)。
　　2.一般線性模型分析顯示，RA患者外周血NK細(xì)胞比例不受年齡、病程、關(guān)節(jié)骨侵蝕分級(jí)的影響，主要受疾病活動(dòng)度的影響。
　　3.Pearson和Spearman等級(jí)相關(guān)分析提示，RA患者外周血CD38在淋巴細(xì)胞表達(dá)頻數(shù)與CRP、疾病活動(dòng)度(DAS28-

8、CRP)呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，而與類風(fēng)濕血清標(biāo)志物(RF、anti-CCP)是否陽(yáng)性，年齡、病程、骨侵蝕分級(jí)無(wú)相關(guān)關(guān)系。線性回歸分析CD38總淋巴細(xì)胞表達(dá)頻數(shù)與CRP、DAS28-CRP相關(guān)系數(shù)分別為R2=0.255和R2=0.288。
　　結(jié)論:
　　1.RA患者外周血中Th細(xì)胞、NK細(xì)胞均高表達(dá)活化標(biāo)記CD38分子，說(shuō)明以上兩種細(xì)胞處于激活狀態(tài)，
　　2.RA患者外周血NK細(xì)胞比例較健康人群減少，其比例受到疾病活動(dòng)度影響

9、。
　　3.CD38在淋巴細(xì)胞表達(dá)頻數(shù)與CRP、DAS28-CRP呈線性正相關(guān)關(guān)系。
　　第二部分
　　目的:
　　研究NK細(xì)胞及其CD38陽(yáng)性亞群在RA患者外周血、滑液、滑膜組織中的分布特征。
　　方法:
　　選取合并單或雙側(cè)膝關(guān)節(jié)積液的RA患者36例，以及性別、年齡與RA患者匹配的29例來(lái)自體檢中心的正常健康人作健康對(duì)照組。流式細(xì)胞儀檢測(cè)健康人外周血和患者配對(duì)的外周血、膝關(guān)節(jié)滑液中NK、CD38亞

10、群、及NK細(xì)胞表面趨化因子受體(CXCR3、CCR5)、顆粒酶B、穿孔素的表達(dá)。采用酶消化法分別制備10例RA新鮮滑膜組織單細(xì)胞懸液，密度梯度離心法獲得淋巴細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定滑膜組織中NK、CD38亞群細(xì)胞比例。35例行關(guān)節(jié)鏡或關(guān)節(jié)置換術(shù)RA患者和25例行關(guān)節(jié)置換術(shù)OA患者的術(shù)后石蠟包埋的滑膜組織，做CD38和CD56分子免疫組化。
　　結(jié)果:
　　1.RA患者滑液中NK細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的比例顯著高于患者外周血，兩者間有統(tǒng)計(jì)

11、學(xué)差異（P＜0.05）。RA患者外周血中NK細(xì)胞高表達(dá)趨化因子受體CCR5和CXCR3，與正常健康人群存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，兩種趨化因子受體主要表達(dá)于CD38+NK細(xì)胞亞群。
　　2.RA患者滑液NK細(xì)胞表達(dá)顆粒酶B和穿孔素水平高于自身外周血和正常健康人群外周血(P值均小于0.05)。
　　3.RA患者外周血和滑液NK細(xì)胞上CD38分子表達(dá)水平均高于正常健康人群外周血（P值均小于0.05）。
　　4.免疫組化

12、顯示，滑膜襯里層、襯里下層浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞均可見(jiàn)CD38的棕黃色陽(yáng)性表達(dá)，染色強(qiáng)度為中等，成塊狀或均質(zhì)樣分布;CD56染色陽(yáng)性細(xì)胞主要表達(dá)于血管內(nèi)及其周圍組織。
　　結(jié)論:
　　1.RA患者炎癥部位（滑液、滑膜）均存在NK細(xì)胞異常浸潤(rùn)。
　　2.RA患者外周血NK細(xì)胞高表達(dá)CC族趨化因子，并集中表達(dá)在CD38+NK細(xì)胞表面;而RA患者滑液NK細(xì)胞高表達(dá)顆粒酶、穿孔素。說(shuō)明RA患者外周血和滑液NK細(xì)胞功能存在

13、差異，外周血NK細(xì)胞趨化能力較強(qiáng)，而滑液中NK細(xì)胞更具殺傷能力。
　　3.RA患者外周血和滑液NK細(xì)胞均高表達(dá)CD38分子，提示CD38分子可能參與NK細(xì)胞趨化和殺傷兩種功能的調(diào)節(jié)。
　　第三部分
　　目的:
　　研究CD38分子對(duì)RA患者外周血和滑液淋巴細(xì)胞功能的影響和調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　方法:
　　選取6例合并單、雙側(cè)膝關(guān)節(jié)滑膜積液的RA患者，配對(duì)采集患者肝素鈉抗凝新鮮外周靜脈血和膝關(guān)節(jié)滑液，梯度密度

14、離心法分離外周血和滑液淋巴細(xì)胞。
　　結(jié)果:
　　1.RA外周血和滑液NK細(xì)胞上顆粒酶B和穿孔素表達(dá)在IB4組有上升趨勢(shì)，但與空白對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，聯(lián)合IL-2刺激后外周血淋巴細(xì)胞和滑液淋巴細(xì)胞中NK細(xì)胞顆粒酶B和穿孔素表達(dá)水平顯著提高，與空白對(duì)照組和IB4組比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P值均小于0.05)。
　　2.與空白對(duì)照組相比，IB4、IL-2+IB4聯(lián)合刺激均顯著增加了外周血淋巴細(xì)胞和滑液淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-

15、6和TNF-α的分泌量（P值均小于0.05）。IB4組和IL-2+IB4聯(lián)合刺激組之間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　3.無(wú)論空白對(duì)照組和IB4組、IL-2+IB4聯(lián)合刺激組，滑液NK細(xì)胞上顆粒酶B和穿孔素的表達(dá)水平均顯著高于外周血NK細(xì)胞，兩者間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P值均小于0.05）;而滑液淋巴細(xì)胞與外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6和TNF-α的分泌量?jī)H在IL-2+IB4聯(lián)合刺激組，兩者之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。<

16、br>　　4.CD38-siRNA干擾處理RA外周血淋巴細(xì)胞后，RA外周血淋巴細(xì)胞內(nèi)PLC-γ1蛋白水平明顯下降，PLC-γ1條帶的灰度值低于空白對(duì)照組;而應(yīng)用IB4刺激處理后，RA外周血血淋巴細(xì)胞內(nèi)PLC-γ1蛋白的表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組，三組間PLC-γ1條帶的灰度值均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P值均小于0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.刺激CD38分子能顯著提高RA患者外周血和滑液中淋巴細(xì)胞分泌促炎性細(xì)胞因子的能力。
　　

17、2.刺激CD38分子可增強(qiáng)RA患者外周血和滑液NK細(xì)胞的殺傷能力;聯(lián)合IL-2，這種增強(qiáng)作用顯著放大。
　　3.CD38可通過(guò)蛋白激酶C通路介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)蛋白磷酸化，阻斷CD38分子可降低胞內(nèi)蛋白磷酸化水平。
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:數(shù)值采用Mean+SD表示，采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。經(jīng)0ne-Sample Kolmogorov-Smirnov Test檢測(cè)數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布;兩組均數(shù)之間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或