EGFR-TKIs通過下調(diào)黏附分子CD44表達(dá)抑制非小細(xì)胞肺癌的轉(zhuǎn)移.pdf

1、目的：肺癌是世界上發(fā)病率死亡率均居于首位的惡性腫瘤，其中非小細(xì)胞肺癌占所有肺癌的80-85％。異質(zhì)性強(qiáng)、生物學(xué)行為復(fù)雜易于侵襲轉(zhuǎn)移是其主要特點(diǎn)，而易于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移進(jìn)入晚期又是導(dǎo)致臨床治療失敗及患者死亡的最主要原因之一。近年，以表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs）為代表的高效、低毒的分子靶向藥物在治療EG

2、FR突變的非小細(xì)胞肺癌領(lǐng)域取得了突破性進(jìn)展，并被美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network,NCCN）推薦作為表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）突變晚期非小細(xì)胞肺癌治療的首選藥物。EGFR-TKI的主要作用機(jī)制是通過干預(yù)腫瘤細(xì)胞EGFR胞內(nèi)區(qū)的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，阻止其異?；罨?，進(jìn)而阻斷下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)

3、腫瘤細(xì)胞凋亡等作用。然而臨床效果觀察發(fā)現(xiàn)，部分服用EGFR-TKI的患者不僅腫瘤生長(zhǎng)受到抑制，其整體轉(zhuǎn)移趨勢(shì)也受到影響。這就提示EGFR-TKI可能不僅作用于腫瘤細(xì)胞本身，很可能還通過某種潛在途徑調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，進(jìn)而對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移產(chǎn)生影響，但具體機(jī)制目前還尚不明了。
　　黏附分子CD44是腫瘤微環(huán)境中黏附分子家族重要成員之一，其可介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞之間、細(xì)胞與基質(zhì)之間的黏附作用，并通過參與一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)為腫瘤轉(zhuǎn)移提供足夠動(dòng)力。從頭頸部腫瘤

4、、乳腺癌等的研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，EGFR信號(hào)通路與CD44之間可能存在著某種交叉協(xié)同關(guān)系，并在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，但二者在非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）中是否也存在這種交互作用并對(duì)轉(zhuǎn)移產(chǎn)生影響以及具體機(jī)制目前還不清楚。遂本研究的目的即通過多種體外實(shí)驗(yàn)方法探討在EGFR突變的NSCLC細(xì)胞系中，EGFR-TKI抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制是否與下調(diào)黏附分子CD44表達(dá)有關(guān)，并初步探索連接二者信號(hào)通路

5、的關(guān)鍵信號(hào)分子。此研究不僅有利于我們對(duì)信號(hào)通路產(chǎn)生更深入的認(rèn)識(shí)，更為未來尋找更多抑制轉(zhuǎn)移的新藥尋求靶點(diǎn)。
　　方法：
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)使用含15%胎牛血清、100U/ml青霉素及100μg/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)HCC827細(xì)胞（EGFR19外顯子突變肺腺癌細(xì)胞）和A549細(xì)胞（EGFR野生型肺腺癌細(xì)胞），置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中，隔天換液，細(xì)胞長(zhǎng)至80%以上處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　

6、　2.采用實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)方法分別檢測(cè)HCC827細(xì)胞（EGFR突變型）和A549細(xì)胞（EGFR野生型）對(duì)EGFR-TKI代表藥物厄洛替尼的敏感性，進(jìn)一步確定實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞。
　　3.四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)不同濃度厄洛替尼對(duì)HCC827的增殖抑制作用。在加入相應(yīng)濃度藥物的同時(shí)并加入合適濃度（50ng/ml）的EGF刺激因子，以模擬人體內(nèi)環(huán)境，藥物作用48h后計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率及半數(shù)抑制濃度（IC50），做出增殖抑制率曲線

7、。
　　4.采用Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)及劃痕實(shí)驗(yàn)分別觀察四組（control、EGF（50ng/ml）刺激組、厄洛替尼（0.3μM）+EGF（50ng/ml）處理組、CD44中和抗體（20μg/ml）+EGF（50ng/ml）處理組）腫瘤細(xì)胞侵襲及遷移能力的變化情況。
　　5.采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)三組（control、EGF（50ng/ml）刺激組、厄洛替尼（0.3μM）+EGF（50ng/ml）處理組）腫瘤細(xì)胞表面C

8、D44表達(dá)情況。
　　6.采用Western-blot實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)三組（control、EGF（50ng/ml）刺激組、厄洛替尼（0.3μM）+EGF（50ng/ml）處理組）腫瘤細(xì)胞CD44蛋白表達(dá)水平變化。
　　7.采用qRT-PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)三組（control、EGF（50ng/ml）刺激組、厄洛替尼（0.3μM）+EGF（50ng/ml）處理組）腫瘤細(xì)胞CD44mRNA的表達(dá)水平變化。
　　8.采用West

9、ern-blot實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)四組（control、EGF（50ng/ml）刺激組、厄洛替尼（0.3μM）+EGF（50ng/ml）處理組、STAT3阻斷劑（S3I-20150μM）+EGF（50ng/ml）處理組）細(xì)胞CD44、STAT3、磷酸化STAT3蛋白表達(dá)水平。
　　9.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量數(shù)據(jù)以x±s或M±QR表示，組間比較以單因素方差分析或秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，LSD法進(jìn)行各組間兩

10、兩比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果如Fig.1所示：EGFR-TKI代表藥物厄洛替尼（0.3μM）對(duì)EGFR突變的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系HCC827具有較強(qiáng)的增殖抑制作用，并呈現(xiàn)時(shí)間依賴性；而對(duì)EGFR野生型的肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549幾乎不產(chǎn)生作用；遂選定HCC827進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2.MTT法檢測(cè)不同濃度厄洛替尼對(duì)HCC827細(xì)胞的增殖抑制作

11、用，結(jié)果顯示：隨著藥物濃度增大（0.001、0.01、0.1、0.5、1、10μM），厄洛替尼作用HCC827細(xì)胞48h后的增殖抑制率也逐漸增高，且呈劑量依賴性（Fig.2、Table1，P＜0.05）。結(jié)合細(xì)胞增殖抑制率，采用直線回歸方法得出IC50為0.323μM；
　　3.Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果如Fig.3、Fig.4和Table2所示：control、EGF刺激組、厄洛替尼+EGF處理組、CD44中和抗體+EGF處

12、理組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為（64.07±1.51）個(gè)、（129.53±4.20）個(gè)、（21.0±1.06）個(gè)、（23.87±1.70）個(gè)；實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果如Fig.5、Fig.6和Table3所示：各組細(xì)胞遷移距離分別為（78.65±3.19）μm、（119.98±1.62）μm、（51.73±4.23）μm、（53.18±6.71）μm；實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；結(jié)

13、果證明厄洛替尼可抑制HCC827細(xì)胞的侵襲遷移能力。
　　4.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)三組（control、EGF（50ng/ml）刺激組、厄洛替尼（0.3μM）+EGF（50ng/ml）處理組）HCC827細(xì)胞表面CD44表達(dá)水平分別為（25.87±3.46）%、（48.37±2.21）%、（15.50±1.11）%；結(jié)果顯示加入厄洛替尼后細(xì)胞表面CD44表達(dá)顯著低于前兩組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Fig.7、Table4，P＜0.05）；

14、r>　　5.Western-blot方法檢測(cè)三組（同4）腫瘤細(xì)胞CD44蛋白半定量結(jié)果分別為（0.72±0.03）、（0.83±0.04）、（0.21±0.03），加入厄洛替尼組CD44蛋白表達(dá)顯著低于對(duì)照組和EGF刺激組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Fig.8、Table5，P＜0.05）；結(jié)果從蛋白水平進(jìn)一步證明厄洛替尼可下調(diào)CD44表達(dá)。
　　6.qRT-PCR法檢測(cè)三組（同4）腫瘤細(xì)胞CD44 mRNA表達(dá)變化：設(shè)對(duì)照組為1，EGF

15、刺激組及厄洛替尼+EGF處理組CD44 mRNA表達(dá)量分別是對(duì)照組的（2.22±0.17）倍和（0.50±0.04）倍；差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Fig.9、Table6，P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)結(jié)果從基因水平上再次證明厄洛替尼可下調(diào)CD44表達(dá)。
　　7.Western-blot方法檢測(cè)四組（control、EGF（50ng/ml）刺激組、厄洛替尼（0.3μM）+EGF（50ng/ml）處理組、STAT3阻斷劑（S3I-20150μM）+E

16、GF（50ng/ml）處理組）腫瘤細(xì)胞CD44、STAT3、磷酸化STAT3蛋白表達(dá)水平，結(jié)果如Fig.10、Fig.11、Fig.12和Table7所示：與對(duì)照組比較，厄洛替尼組CD44和p-STAT3蛋白表達(dá)水平均被顯著下調(diào)（P＜0.05），而在使用STAT3特異性阻斷劑阻斷STAT3信號(hào)通路后CD44蛋白表達(dá)仍被下調(diào)（P＜0.05）；綜合以上結(jié)果初步得出，厄洛替尼阻斷EGFR信號(hào)通路的同時(shí)，其間接下調(diào)黏附分子CD44表達(dá)很可能是通

17、過EGFR/STAT3信號(hào)通路進(jìn)行的，但其深入機(jī)制還需進(jìn)一步探索。
　　結(jié)論：
　　1.HCC827細(xì)胞對(duì)EGFR-TKI代表藥物厄洛替尼高度敏感，適合作為本實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞。
　　2.EGFR-TKI藥物不僅可顯著抑制EGFR突變NSCLC細(xì)胞株HCC827細(xì)胞的增殖，還對(duì)其侵襲轉(zhuǎn)移能力產(chǎn)生明顯影響，并可能與CD44被下調(diào)有關(guān)。
　　3.EGFR-TKI藥物可明顯下調(diào)黏附分子CD44表達(dá)，且可能與EGFR/STAT3