巨噬細(xì)胞通過刺激血管壁細(xì)胞MicroRNA表達(dá)促進(jìn)移植血管內(nèi)膜重塑.pdf

1、研究背景：血管及臟器移植術(shù)后往往會發(fā)生移植血管再狹窄即移植性血管病(transplant vasculopathy, TV)，是造成移植器官慢性失去功能的主要原因，目前TV發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)機(jī)制尚未完全清楚。前期研究發(fā)現(xiàn)，移植術(shù)后早期即存在血管外膜炎癥，外膜的巨噬細(xì)胞浸潤可能在移植性血管病發(fā)生中起關(guān)鍵作用。因此，本課題采用動脈血管移植模型，通過體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)證明血管外膜早期的單核巨噬細(xì)胞浸潤在促進(jìn)TV病變發(fā)生過程中具有因果作用，并以micr

2、oRNA(miR)-21為例，進(jìn)一步證實(shí)外膜巨噬細(xì)胞通過調(diào)節(jié)血管壁細(xì)胞（主要針對平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞）miR的表達(dá)促進(jìn)移植血管內(nèi)膜重塑的相關(guān)機(jī)制。
　　研究目的：1.確定抑制早期外膜巨噬細(xì)胞浸潤聚集能否抑制移植血管的內(nèi)膜重塑。2.明確巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)血管壁細(xì)胞miR表達(dá)的機(jī)制。3.檢測通過外膜途徑抑制miR的表達(dá)，能否抑制TV的發(fā)生發(fā)展。
　　研究方法：體內(nèi)實(shí)驗(yàn):建立大鼠胸-腹主動脈移植模型，氯膦酸二鈉脂質(zhì)體(clodrona

3、te liposomes)用于體內(nèi)巨噬細(xì)胞耗竭。對移植大鼠進(jìn)行隨機(jī)分組:巨噬細(xì)胞耗竭組(clodronate liposomes)、miR-21抑制組(miR-21 inhibitor)、及其相應(yīng)對照組(control liposomes/control miRNA)。取0、1、2、3、7、14天移植血管進(jìn)行HE染色。測量移植血管的各層增生情況;免疫組織化學(xué)染色檢測CD3, CD68, proliferating cell nuclea

4、r antigen(PCNA), monocyte chemotacticprotein-1(MCP-1),vascular cell adhesion molecule-1(VCAM-1),intercellularadhesion molecule-1(ICAM-1)，α-smooth muscle actin(α-SM actin)的表達(dá)。分離血管外膜和中膜組織，QRT-PCR檢測miR-21，MCP-1，VCAM-1，ICAM-

5、1的表達(dá)。
　　體外實(shí)驗(yàn):分離大鼠胸主動脈外膜和中膜組織，分別做原代細(xì)胞培養(yǎng)。制作RAW264.0巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基，ELISA檢測條件培養(yǎng)基內(nèi)各類細(xì)胞因子的含量，如:tumor necrosis factor-α(TNF-α),transforming growth factor-β1(TGF-β)等。用TNF-α細(xì)胞因子刺激外膜的成纖維細(xì)胞/中膜的平滑肌細(xì)胞，QRT-PCR檢測miR-21表達(dá);條件培養(yǎng)基培養(yǎng)外膜成纖維細(xì)胞/中

6、膜平滑肌細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組加入TNF-α中和抗體，QRT-PCR檢測miR-21表達(dá)。TNF-α刺激外膜成纖維細(xì)胞/中膜平滑肌細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitor，EDU和Transwell檢測細(xì)胞的增殖、遷移能力，QRT-PCR檢測miR-21，MCP-1，VCAM-1，ICAM-1，CCL-5。外膜成纖維細(xì)胞/中膜平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-21 mimic，QRT-PCR檢測MCP-1，VCAM-1，ICAM-1。
　　研究

7、結(jié)果：1.巨噬細(xì)胞耗竭能夠減輕血管內(nèi)膜的增生和移植導(dǎo)致的外膜炎癥。巨噬細(xì)胞耗竭顯著降低血管壁miR-21的表達(dá)。QRT-PCR結(jié)果顯示，體內(nèi)干預(yù)耗竭巨噬細(xì)胞后MCP-1，VCAM-1，ICAM-1的表達(dá)均降低。與其空白對照組相比，miR-21抑制劑干預(yù)后血管內(nèi)膜增生也顯著減弱;免疫組化結(jié)果顯示，與其對照組相比，巨噬細(xì)胞耗竭組和miR-21抑制組CD68，PCNA，MCP-1，VCAM-1，ICAM-1的表達(dá)均減少。
　　2.巨噬細(xì)

8、胞通過旁分泌TNF-α調(diào)節(jié)miR-21在外膜的成纖維細(xì)胞和中膜的平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)。ELISA結(jié)果顯示，巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基中含有TNF-α等細(xì)胞因子;QRT-PCR結(jié)果顯示，TNF-α可上調(diào)miR-21在外膜的成纖維細(xì)胞和中膜的平滑肌細(xì)胞中的表達(dá);條件培養(yǎng)基培養(yǎng)外膜的成纖維細(xì)胞及中膜的平滑肌細(xì)胞，QRT-PCR結(jié)果顯示，添加TNF-α中和抗體組miR-21的表達(dá)下調(diào)。
　　3.沉默miR-21可抑制TNF-α導(dǎo)致的外膜的成纖維細(xì)胞

9、及中膜的平滑肌細(xì)胞增殖、遷移及炎癥反應(yīng)。TNF-α刺激外膜成纖維細(xì)胞及中膜平滑肌細(xì)胞，EDU和Transwell結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitor組外膜的成纖維細(xì)胞及中膜的平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移能力均減弱;QRT-PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitor組外膜的成纖維細(xì)胞/中膜的平滑肌細(xì)胞的miR-21，MCP-1，VCAM-1，ICAM-1表達(dá)均降低。
　　4.miR-21可以促進(jìn)外膜的成纖維細(xì)胞/中膜的

10、平滑肌細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。QRT-PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-21 mimic組，外膜成纖維細(xì)胞MCP-1，VCAM-1表達(dá)上調(diào)，中膜平滑肌細(xì)胞MCP-1表達(dá)上調(diào)。
　　研究結(jié)論
　　1.移植血管外膜巨噬細(xì)胞在新生內(nèi)膜發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。
　　2.巨噬細(xì)胞通過旁分泌TNF-α調(diào)節(jié)血管壁細(xì)胞miR-21的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)血管壁細(xì)胞的功能變化及炎癥反應(yīng)。
　　3.血管壁細(xì)胞中表達(dá)的miR-21可能通過影響移植血管的炎癥