血管外膜激活促進(jìn)移植性血管病新內(nèi)膜形成及發(fā)展的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　 本實(shí)驗(yàn)利用袖套管技術(shù)將大鼠胸主動(dòng)脈移植到腹主動(dòng)脈建立移植性血管病模型,通過(guò)在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及體外培養(yǎng)移植血管外膜成纖維細(xì)胞,觀察血管外膜細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化、增殖、遷移以及多種細(xì)胞因子在mRNA和蛋白水平表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化,進(jìn)一步探討血管外膜以及外膜成纖維細(xì)胞激活在移植性血管病新內(nèi)膜形成及發(fā)展中的作用機(jī)制。在以上實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,本研究進(jìn)一步探討應(yīng)用RNA干擾技術(shù)特異性地抑制NADPH氧化酶亞基p47phox的表達(dá),從而下調(diào)NADPH

2、氧化酶的活性,觀察其對(duì)移植血管外膜成纖維細(xì)胞增殖和遷移的抑制作用,為移植性血管病以血管外膜成纖維細(xì)胞為作用靶點(diǎn)進(jìn)行基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 本課題分以下三個(gè)部分進(jìn)行研究:
　　 第一部分:移植性血管病大鼠模型的建立
　　 方法:
　　 以Sprague-Dawley大鼠的胸主動(dòng)脈為供體血管,利用袖套管技術(shù)移植到Wistar大鼠腹主動(dòng)脈作為異系移植實(shí)驗(yàn)組,以SD大鼠對(duì)SD大鼠同系移植作為對(duì)照組。在血管移

3、植后3,7,14天,取出移植的胸主動(dòng)脈,進(jìn)行蘇木素-伊紅染色及Weigert彈力纖維染色,應(yīng)用Image-Pro Plus5.0計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)移植血管的內(nèi)膜和中膜增生情況及內(nèi)膜/中膜厚度比值。
　　 結(jié)果:
　　 手術(shù)成功率為90％,移植血管的通暢率達(dá)100％。同系移植對(duì)照組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)未出現(xiàn)內(nèi)膜的明顯增生,而異系移植實(shí)驗(yàn)組在移植后7天出現(xiàn)內(nèi)膜增生,術(shù)后14天內(nèi)膜厚度顯著增加。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組移植血管中膜均未見明顯

4、增厚。異系移植實(shí)驗(yàn)組內(nèi)膜/中膜厚度比值在移植后7天開始增高,14天時(shí)達(dá)到頂峰。
　　 結(jié)論:
　　 利用袖套管技術(shù)進(jìn)行SD和Wistar大鼠間的血管移植符合移植性血管病的病理形態(tài)改變,并且操作簡(jiǎn)單,費(fèi)用小,重復(fù)性好,可以用于研究移植性血管病的病理機(jī)制及干預(yù)治療。
　　 第二部分:在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究血管外膜激活在移植性血管病新內(nèi)膜形成及發(fā)展中的作用
　　 方法:
　　 在血管移植后3,7,14天,取出

5、移植的胸主動(dòng)脈。用免疫組織化學(xué)方法觀察不同時(shí)間點(diǎn)血管外膜和內(nèi)膜波形蛋白,α平滑肌肌動(dòng)蛋白,T細(xì)胞抗原受體CD3,細(xì)胞核增殖抗原Ki-67,核因子-κB,MCP-1,細(xì)胞間粘附分子-1,血管細(xì)胞粘附分子-1,基質(zhì)金屬蛋白酶-7,TGF-β1,硝基酪氨酸及p47phox等細(xì)胞因子蛋白水平表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化；用熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)gp91phox mRNA的表達(dá)水平；用熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)移植血管外膜MCP-1,IL-1β,TNFα,IC

6、AM-1,VCAM-1,MMP-7,TGF-β1,gp91phox和p47phox等細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:
　　 1.免疫組織化學(xué)檢測(cè)顯示異系移植實(shí)驗(yàn)組和同系移植對(duì)照組在血管移植后不同時(shí)間點(diǎn),移植血管外膜及內(nèi)膜或新內(nèi)膜的大部分細(xì)胞呈現(xiàn)vimentin陽(yáng)性,中膜幾乎無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞。異系移植實(shí)驗(yàn)組在術(shù)后3天移植血管外膜部分細(xì)胞即呈現(xiàn)α-SMA陽(yáng)性,隨著時(shí)間延長(zhǎng)α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量逐漸增加,術(shù)后7天和14天新

7、內(nèi)膜細(xì)胞也開始表達(dá)α-SMA,而同系移植對(duì)照組血管外膜及內(nèi)膜細(xì)胞幾乎無(wú)α-SMA陽(yáng)性表達(dá):兩組移植血管中膜α-SMA始終呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。
　　 2.異系移植實(shí)驗(yàn)組和同系移植對(duì)照組在血管移植后不同時(shí)間點(diǎn)移植血管外膜及內(nèi)膜或新內(nèi)膜T細(xì)胞抗原受體CD3陽(yáng)性細(xì)胞不超過(guò)4％,說(shuō)明增生的細(xì)胞主要是外膜成纖維細(xì)胞,新內(nèi)膜形成可能主要與外膜成纖維細(xì)胞有關(guān)。
　　 3.Ki-67免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示在術(shù)后3天異系移植實(shí)驗(yàn)組外膜成纖維細(xì)胞開始

8、出現(xiàn)增殖,內(nèi)膜細(xì)胞僅有少量細(xì)胞增殖,在術(shù)后7天和14天外膜成纖維細(xì)胞及內(nèi)膜細(xì)胞均顯著增生；同系移植對(duì)照組術(shù)后外膜僅出現(xiàn)少量細(xì)胞增生。兩組移植血管中膜平滑肌細(xì)胞未見增生細(xì)胞,中膜厚度也未見明顯改變。
　　 4.免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示在術(shù)后3天異系移植實(shí)驗(yàn)組外膜成纖維細(xì)胞開始出現(xiàn)NF-κB,MCP-1,ICAM-1,VCAM-1,MMP-7,TGF-β1,硝基酪氨酸,p47phox的表達(dá),內(nèi)膜有少量陽(yáng)性細(xì)胞,在術(shù)后7天和14天外膜成纖

9、維細(xì)胞及內(nèi)膜細(xì)胞細(xì)胞因子表達(dá)均顯著增加；同系移植對(duì)照組僅NF-κB,MCP-1、ICAM-1、VCAM-1、硝基酪氨酸在術(shù)后外膜出現(xiàn)少量陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞,內(nèi)膜未檢測(cè)到陽(yáng)性細(xì)胞。
　　 5.熒光原位雜交技術(shù)顯示在術(shù)后3天異系移植實(shí)驗(yàn)組外膜成纖維細(xì)胞檢測(cè)到gp91phox mRNA表達(dá),在術(shù)后7天和14天外膜成纖維細(xì)胞gp91phox mRNA表達(dá)顯著增加,內(nèi)膜僅有少量gp91phox mRNA表達(dá)；同系移植對(duì)照組未檢測(cè)到gp91pho

10、xmRNA表達(dá)。
　　 6.QRT-PCR結(jié)果顯示與同系移植對(duì)照組相比,異系移植實(shí)驗(yàn)組外膜成纖維細(xì)胞MCP-1,IL-1β,TNFα,ICAM-1,VCAM-1,MMP-7,TGF-β1,gp91phox和p47phoxmRNA均在術(shù)后3天開始表達(dá),術(shù)后14天達(dá)到頂峰。
　　 結(jié)論:
　　 1.在移植性血管病早期新內(nèi)膜形成前,動(dòng)脈外膜首先被激活,主要表現(xiàn)為外膜成纖維細(xì)胞被激活,開始表達(dá)α-SMA,表型轉(zhuǎn)化為肌成纖

11、維細(xì)胞,增殖活性增強(qiáng),合成釋放多種活性細(xì)胞因子,促進(jìn)移植性血管病新內(nèi)膜形成及發(fā)展。
　　 2.動(dòng)脈外膜炎癥是移植性血管病新內(nèi)膜形成及發(fā)展過(guò)程中的早期事件之一,有可能促進(jìn)血管新內(nèi)膜的形成。
　　 3.氧化應(yīng)激貫穿于移植性血管病新內(nèi)膜形成及發(fā)展整個(gè)過(guò)程中,可能是血管外膜成纖維細(xì)胞被激活的因?yàn)橹?并進(jìn)而促進(jìn)移植性血管病新內(nèi)膜形成及發(fā)展。
　　 第三部分:體外培養(yǎng)大鼠血管外膜成纖維細(xì)胞研究其在移植性血管病新內(nèi)膜形成及發(fā)

12、展中的作用
　　 方法:
　　 異系移植實(shí)驗(yàn)組和同系移植對(duì)照組在血管移植后14天分別取出移植胸主動(dòng)脈,將血管外膜剝離,用組織塊培養(yǎng)法體外培養(yǎng)血管外膜成纖維細(xì)胞,取3～6代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。用免疫細(xì)胞熒光染色檢測(cè)vimentin,α-SMA及結(jié)蛋白desmin的表達(dá)；用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒及5-溴-2-脫氧尿嘧啶摻入法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性的變化；用流式細(xì)胞儀PI染色法檢測(cè)細(xì)胞周期；用插入式24孔Transwell小室及劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的

13、遷移能力；用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢澳 MCP-1,IL-1β,TNFα,ICAM-1,VCAM-1,MMP-7,TGF-β1,gp91phox和p47phox等細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)水平；用Western blot方法檢測(cè)MCP-1,ICAM-1,TGF-β1,和p47phox等細(xì)胞因子蛋白的表達(dá)水平:設(shè)計(jì)合成靶向NADPH氧化酶亞基p47phox基因的小分子干擾RNA,并進(jìn)行篩選得到具有高效干擾效率的siRNA,轉(zhuǎn)染異系移植實(shí)驗(yàn)組體外培

14、養(yǎng)血管外膜成纖維細(xì)胞,觀察其對(duì)血管外膜成纖維細(xì)胞NADPH氧化酶的抑制作用及其對(duì)外膜成纖維細(xì)胞增殖和遷移活性的抑制作用。
　　 結(jié)果:
　　 1.用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)的異系移植實(shí)驗(yàn)組和同系移植對(duì)照組血管外膜細(xì)胞,4～7天后可見細(xì)胞從組織塊邊緣游出,貼壁生長(zhǎng),10～14天后達(dá)到90％細(xì)胞融合。異系移植實(shí)驗(yàn)組血管外膜細(xì)胞呈現(xiàn)vimentin(+)、desmin(-)、約90％的細(xì)胞呈現(xiàn)α-SMA(+)；同系移植對(duì)照組血管外膜細(xì)

15、胞呈現(xiàn)vimentin(+)、desmin(-)、90％以上的細(xì)胞呈現(xiàn)α-SMA(-)。
　　 2.血清濃度為1％時(shí),異系移植實(shí)驗(yàn)組和同系移植對(duì)照組培養(yǎng)血管外膜成纖維細(xì)胞細(xì)胞增殖活性無(wú)顯著性差異,血清濃度為5％和10％時(shí),異系移植實(shí)驗(yàn)組血管外膜成纖維細(xì)胞增殖活性顯著高于同系移植對(duì)照組；血清濃度為10％時(shí),BrdU摻入法也得到相同結(jié)果。流式細(xì)胞儀PI染色法顯示異系移植實(shí)驗(yàn)組血管外膜成纖維細(xì)胞S期及G2/M期所占百分比顯著高于同系移

16、植對(duì)照組。
　　 3.插入式24孔Transwell小室實(shí)驗(yàn)顯示異系移植實(shí)驗(yàn)組遷移到Transwell小室PET膜下表面的成纖維細(xì)胞數(shù)明顯高于同系移植對(duì)照組；劃痕實(shí)驗(yàn)也顯示異系移植實(shí)驗(yàn)組血管外膜成纖維細(xì)胞的愈合速率要明顯高于同系移植對(duì)照組。
　　 4.RT-PCR檢測(cè)顯示異系移植實(shí)驗(yàn)組血管外膜成纖維細(xì)胞MCP-1,IL-1β,TNFα,ICAM-1,VCAM-1,MMP-7,TGF-β1,gp91phox和p47phox

17、等細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)水平均明顯高于同系移植對(duì)照組。
　　 5.Western blot方法檢測(cè)顯示異系移植實(shí)驗(yàn)組血管外膜成纖維細(xì)胞MCP-1,ICAM-1,TGF-β1和p47phox等細(xì)胞因子蛋白的表達(dá)水平也明顯高于同系移植對(duì)照組。
　　 6.p47phox-siRNA-2＃轉(zhuǎn)染異系移植實(shí)驗(yàn)組體外培養(yǎng)血管外膜成纖維細(xì)胞48小時(shí)后可有效抑制p47phox基因在mRNA水平的表達(dá),從而抑制NADPH氧化酶,并可以顯著降

18、低成纖維細(xì)胞的增殖和遷移活性。
　　 結(jié)論:
　　 1.約90％的異系移植實(shí)驗(yàn)組血管外膜細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞,而同系移植對(duì)照組90％以上的細(xì)胞為成纖維細(xì)胞。
　　 2.異系移植實(shí)驗(yàn)組血管外膜成纖維細(xì)胞的增殖及遷移能力明顯高于同系移植對(duì)照組。
　　 3.異系移植實(shí)驗(yàn)組血管外膜成纖維細(xì)胞合成和釋放多種活性細(xì)胞因子的能力明顯高于同系移植對(duì)照組。
　　 4.氧化應(yīng)激參與血管外膜成纖維細(xì)胞的激活,激活的成