血管內(nèi)皮細(xì)胞Deptor缺失mTOR信號(hào)通路活化促進(jìn)血管增多.pdf

1、一、研究背景:
　　血管的生成具體指的是在原來(lái)存在的血管附近，生長(zhǎng)出其他新生的血管。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（英文名字為VEGFs），是指可以促進(jìn)血管生成的一種細(xì)胞分泌因子，可以很好的保持血管內(nèi)膜的完整性。據(jù)報(bào)道，在體外實(shí)驗(yàn)中，DEPTOR在調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞激活和在炎癥及血管生成中起重要的作用。可是，關(guān)于DEPTOR在生物體內(nèi)微血管的生成中的具體作用還不清楚。
　　因此，我們想在體內(nèi)首次證實(shí)DEPTOR與血管生成的關(guān)系。
　　

2、二、研究方法:
　　1、在Cre-loxP系統(tǒng)上，我們構(gòu)建了在血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性進(jìn)行DEPTOR敲除的小鼠。
　　2、驗(yàn)證血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性DEPTOR敲除小鼠敲除效果。
　　3、采用蘇木素-伊紅染色、免疫組織化學(xué)及western blot等方法，檢測(cè)敲除小鼠中血管數(shù)量變化等表達(dá)情況。觀察用雷帕霉素處理后血管數(shù)量的變化。
　　4、檢測(cè)KO小鼠VEGF和HIF-1α表達(dá)情況。觀察用雷帕霉素處理后的變化。
　　

3、5、HUVECs轉(zhuǎn)染DEPTOR siRNA，觀察CD31以及促血管生成因子、缺氧誘導(dǎo)因子的變化情況。觀察用雷帕霉素處理后的變化。設(shè)置對(duì)照組、轉(zhuǎn)染DEPTOR siRNA組、轉(zhuǎn)染DEPTOR siRNA+雷帕霉素組，觀察各組HUVEC小管形成情況。
　　三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　在此實(shí)驗(yàn)中，所有數(shù)據(jù)結(jié)果均重復(fù)3次或以上，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤來(lái)表示，數(shù)組間用t檢驗(yàn)及兩因素方差分析進(jìn)行分析。當(dāng)P＜0.05代表結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　

4、　四、研究結(jié)果:
　　1、成功構(gòu)建了在血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行特異性DEPTOR敲除的小鼠。免疫熒光染色表明DEPTOR蛋白表達(dá)在CD31標(biāo)記的KO小鼠的血管EC中降低。與WT小鼠相比，Western blot結(jié)果證明，在KO小鼠組織中的Deptor表達(dá)顯著降低。
　　2、血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性敲除Deptor激活mTOR信號(hào)。與WT小鼠相比，KO小鼠組織中pS6明顯升高。
　　3、血管內(nèi)皮細(xì)胞敲除Deptor促進(jìn)了組織血管生成，

5、并且雷帕霉素可以逆轉(zhuǎn)這一表型。與WT小鼠相比，KO小鼠組織，CD31組織化學(xué)染色數(shù)量顯著增加。用雷帕霉素處理KO小鼠時(shí)，CD31組織化學(xué)染色減少。western blot結(jié)果與其一致。
　　4、在KO小鼠中，VEGF和HIF-1α的表達(dá)增加，雷帕霉素可以逆轉(zhuǎn)這一表型。免疫組織化學(xué)染色顯示，與WT小鼠相比，KO小鼠的組織中VEGF和HIF-1α的表達(dá)增加。用雷帕霉素處理后，與KO小鼠相比，KO+RAPA小鼠中VEGF的染色數(shù)量明顯減

6、少，Western blot結(jié)果一致。
　　5、用DEPTOR siRNA轉(zhuǎn)染HUVEC，CD31，VEGF和HIF-1α的表達(dá)也顯著增加。用雷帕霉素處理，抑制了pS6K，pS6的增加，且CD31，VEGF和HIF-1α的表達(dá)明顯減少。與對(duì)照組相比，加入DEPTOR siRNA的HUVEC小管生成增加，而雷帕霉素處理組可逆轉(zhuǎn)增加。
　　五、結(jié)論:
　　1、在血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)敲除Deptor基因，可以促進(jìn)mTOR信號(hào)通路的