趨化-捕獲內皮祖細胞促進移植脂肪血管化的實驗研究.pdf

1、背景：自體脂肪移植已有近百年歷史。但因為游離脂肪細胞移植早期未建立有效血供而導致移植脂肪大量壞死。如何能有效促進移植脂肪血管化進而提高其成活率成為整形外科醫(yī)生困擾已久的問題。近些年各種研究大部分集中在添加各種細胞因子，通過調控血管生長因子達到促進血管化的目的。然而參與新血管形成并非單一的調控環(huán)節(jié)，需要多種細胞因子及相關細胞共同參與、相互作用。CAL技術即在游離脂肪細胞移植技術中添加ADSCs，ADSCs可分泌多種細胞因子及生長因子，在一

2、定程度上提高了移植脂肪成活率，但距離理想的高成活率仍具有一定差距。目前EPC作為內皮細胞的前體細胞，參與血管的生理性及病理性形成。然而生理狀態(tài)下外周血EPC數量極少。體外既使能培養(yǎng)、擴增足量的EPC，但長時間培養(yǎng)后容易導致干細胞分化而失去血管生成能力。大量研究表明，EPC可被基質細胞衍生因子1a（SDF-1a/CXCL12）趨化，通過SDF-1a與CXCR4受體結合激活傳導通路，迅速動歸巢到局部作為主要細胞成分參與血管新生及血管內皮修復

3、。目前國內外有應用SDF-1a作為趨化劑趨化EPC促進血管修復及再通的研究，但尚未見通過應用SDF-1a修飾的脂肪干細胞體內定向趨化EPC促進移植脂肪血管重建的研究。
　　目的：1、脂肪干細胞獲取、鑒定及細胞生長特性研究。2、CXCL12慢病毒載體的構建、轉染脂肪干細胞的可行性研究及目的蛋白的表達檢查。3、過表達目的蛋白CXCL12的脂肪干細胞在體內對EPC的趨化-捕獲作用。4、趨化-捕獲的EPC對移植脂肪組織的成血管作用及對移植

4、脂肪成活率的影響。
　　材料與方法：1.ADSCs的分離培養(yǎng)及鑒定：取臨床吸脂術抽吸脂肪，離心過濾后獲取原代ADSCs培養(yǎng)，流式細胞儀檢測細胞表面抗原及成脂、成骨誘導分化進行鑒定。2.CXCL12慢病毒載體構建、轉染ADSCs并檢測目的蛋白的表達：PCR法與慢病毒系統(tǒng)包裝病毒并轉染ADSCs，Western-blot檢測ADSCs目的蛋白的表達。3.脂肪移植模型的制備及分組：將A、B、C、D四組移植物隨機注入裸鼠背部皮下：A組為C

5、XCL12轉染的ADSCs與脂肪組織混合物;B組為慢病毒空載體轉染的ADSCs與脂肪混合物;C組為正常ADSCs與脂肪混合物;D組為培養(yǎng)基與脂肪混合物。4.EPC的趨化-捕獲情況觀察：術后第2、4、7、14、30天，測外周血EPC數量;western-blot法檢測移植物目的蛋白表達情況。5.移植物成血管情況觀察及對移植脂肪成活率的影響觀察：第2、4、7、14、30天免疫組化切片成血管形成情況的觀察：(1)各組各時間段新生成血管計數;(

6、2)90天組移植物濕重測量;(3)90天移植物“點計數”液化壞死及纖維化程度。6.統(tǒng)計分析。
　　結果：1.分離培養(yǎng)的ADSCs形態(tài)、成脂、成骨誘導，及流式細胞儀檢測均符合脂肪干細胞特性。2.構建的目的基因載體成功轉染ADSCs，篩選后擴增細胞，檢測到轉染后的ADSCs高表達目的蛋白SDF-1a。3.第2、4、7、14、30天檢測外周血單核細胞EPC明顯高于B、C、D組;移植組織目的蛋白表達明顯高于B、C、D組。4.A組脂肪移植物

7、血管形成早于其他組，且血管形成數量多于其他組;5.移植物90天稱重A組平均濕重最大;組織病理切片顯示A組脂肪組織存活最多。
　　結論：1.ADSCs來源豐富，提取方法成熟、操作簡單，細胞具有多向分化能力，并可以分泌多種細胞因子，適合基因轉染，作為目的基因載體具有優(yōu)勢。2.目前慢病毒載體構建技術成熟、高校，構建的過表達SDF-1a的ADSCs在裸鼠體內可長期穩(wěn)定表達目的蛋白。3.在體內ADSCs表達的SDF-1a快速動員骨髓內的EP