基于DNA納米技術(shù)和核酸酶的核酸化學發(fā)光傳感分析.pdf

1、隨著循環(huán)腫瘤DNA、循環(huán)microRNA（miRNA）和融合基因等在臨床疾病發(fā)生和診療中作用的逐步揭示，無細胞核酸分析在生物學研究和醫(yī)學診療中變得日趨重要?；诖?，本論文擬將整合臨床檢驗診斷學和生物分析化學學科交叉的最新研究成果，以DNA納米自組裝和功能核酸酶為納米級工具，結(jié)合臨床檢驗診斷的需求，構(gòu)建一系列簡單、快速、等溫、特異、靈敏、免標記的核酸化學發(fā)光傳感分析新策略。本研究主要包括以下三個部分：
　　1.基于核酸酶級聯(lián)指數(shù)擴增

2、的化學發(fā)光成像用于miRNA傳感分析本研究基于功能核酸酶技術(shù)和級聯(lián)指數(shù)擴增（exponential amplification reaction,EXPAR）分子機器，構(gòu)建高靈敏、高特異且可視化的化學發(fā)光生物傳感器，為循環(huán)miRNA提供全新檢測新策略。研究中發(fā)卡開關(guān)能夠特異識別靶miRNA并形成雜交雙鏈，從而啟動擴增機器I，產(chǎn)生引物鏈。引物鏈與模板II探針互補雜交形成雙鏈進級聯(lián)激活指數(shù)擴增機器II，產(chǎn)生大量G四鏈體辣根過氧化物模擬酶，催

3、化發(fā)光底物發(fā)光，實現(xiàn)信號的轉(zhuǎn)換輸出。發(fā)卡結(jié)構(gòu)DNA分子探針的設(shè)計提高檢測的特異性，級聯(lián)型的指數(shù)擴增提高檢測的靈敏度，功能核酸酶免標記技術(shù)實現(xiàn)信號轉(zhuǎn)導和可視化的miRNA生物傳感分析。本章所構(gòu)建的化學發(fā)光傳感方法檢測miRNA的線性范圍為10fM到100pM，最低檢測限為2.91fM，且具有單堿基錯配分辨能力。同時，該傳感方法具有等溫、均相、免標記和可視化的優(yōu)點，有望為循環(huán)miRNA分析和臨床疾病診斷提供有力的檢測工具。
　　2.基

4、于雙T型DNA納米開關(guān)和核酸酶的化學發(fā)光成像用于BCR/ABL融合基因傳感分析本研究基于DNA納米技術(shù)和級聯(lián)型DNA擴增機器構(gòu)建BCR/ABL融合基因化學發(fā)光型生物傳感器，為融合基因檢測提供超靈敏、高特異的化學發(fā)光成像傳感新策略。利用NUPACK軟件設(shè)計功能化分子探針，其能夠邏輯性識在BCR/ABL融合基因并自組裝形成Bis-3WJ納米結(jié)構(gòu)（Bis-three way junction nanostructure，Bis-3WJ）。該結(jié)

5、構(gòu)激活級聯(lián)擴增機器，產(chǎn)生大量G四鏈體辣根過氧化物模擬酶亞單元。該亞單元能夠自組裝為完整模擬酶，級聯(lián)催化化學發(fā)光底物實現(xiàn)光信號轉(zhuǎn)換輸出和邏輯門操作。本章所構(gòu)建的化學發(fā)光成像檢測BCR/ABL融合基因的最低檢測限23fM，線性范圍達7個數(shù)量級，且具有邏輯識別能力和單堿基錯配分辨能力。該方法在復雜基質(zhì)中顯示好的回收率，具有等溫、均相、免標記的優(yōu)點，為慢性粒細胞白血病診斷提供全新的化學發(fā)光成像策略。
　　3.基于發(fā)卡開關(guān)和原位非線性雜交鏈

6、反應的電致化學發(fā)光用于BCR/ABL融合基因傳感分析本研究基于發(fā)卡探針和原位分支化雜交鏈反應（hybridization chain reaction,HCR）構(gòu)建BCR/ABL融合基因的電化學發(fā)光型生物傳感器，為慢性粒細胞白血病診斷提供操作簡便、超靈敏、高特異的傳感新策略。首先，將捕獲探針固定在金電極。隨后，將分支化雜交鏈反應系統(tǒng)溶液滴加在電極表面，在發(fā)卡開關(guān)上的觸發(fā)鏈DNA觸發(fā)兩種底物鏈和兩種輔助鏈的級聯(lián)自組裝形成分支狀DNA納米結(jié)

7、構(gòu)。在目標分子存在的情況下，其打開發(fā)卡開關(guān)并將分支狀DNA納米結(jié)構(gòu)連接在電極表面。這種原位HCR反應形成的DNA納米結(jié)構(gòu)能夠通過其DNA雙鏈凹槽與電致發(fā)光指示劑(Ru(phen)32+)間的相互作用將隨后加入的指示劑引入到電極表面，從而實現(xiàn)信號的指數(shù)形式的輸出放大。發(fā)卡探針和原位非線性雜交鏈反應的引入到電致發(fā)光傳感器設(shè)計增強了傳感器的特異性和靈敏度。本章所構(gòu)建的ECL方法檢測BCR/ABL融合基因的最低檢測限為5.49fM，線性范圍為1