核糖核酸酶Onconase的表達(dá)及純化.pdf

1、豹蛙酶Onconase(又名：P30 protein，ranpinase)，是一種在北方豹蛙(Rana pipiens)卵母細(xì)胞和早期胚胎內(nèi)存在的核糖核酸酶，屬于核糖核酸酶A超家族。研究證實它在體內(nèi)外對多種腫瘤均具顯著殺傷作用。
　　Onconase的抗腫瘤作用和它的核酸酶活性直接相關(guān)，Onconase通過降解胞質(zhì)內(nèi)tRNA從而使靶細(xì)胞啟動caspase依賴的凋亡途徑。
　　Onconase是第一個進(jìn)入Ⅲ期臨床研究的核糖核酸

2、酶藥物，用于治療惡性間皮瘤。Onconase結(jié)構(gòu)獨特，高度穩(wěn)定，分子量小。在臨床上具有副反應(yīng)較輕，免疫原性低和不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點，因此Onconase的研究在學(xué)術(shù)上和醫(yī)學(xué)應(yīng)用上均具重要意義。
　　我們選用了大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行Onconase蛋白的原核表達(dá)，Bac-To-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行真核表達(dá)，對兩種表達(dá)系統(tǒng)獲得的Onconase蛋白分別進(jìn)行了純化，以期獲得純度較高的Onconase蛋白。
　　原核表達(dá)系統(tǒng)中以

3、invitrogen公司構(gòu)建的pMD 18-T-Onconase為模板，將其插入到大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的pET-30a(+)質(zhì)粒中，構(gòu)建pET-30a(+)-Onconase質(zhì)粒，重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)菌株，實現(xiàn)了Onconase的高效原核表達(dá)。通過SDS-PAGE和Western blotting分析，可見大小約為11 kD的特異性蛋白條帶，表明pET-30a(+)-Onconase在E.coli BL21菌種中

4、成功地表達(dá)了His-Onconase融合蛋白。
　　真核表達(dá)系統(tǒng)中以invitrogen公司構(gòu)建的pMD18-T-Onconase為模板，對Onconase基因進(jìn)行擴(kuò)增，并將其插入到桿狀病毒Bac-To-Bac表達(dá)系統(tǒng)的pFastBacl質(zhì)粒中，構(gòu)建pFastBacI-Onconase質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10Bac后獲得重組穿梭載體Bacmid-Onconase，脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞后產(chǎn)生了具有強(qiáng)感染力的重組桿狀病毒AcNP

5、V-Onconase。用AcNPV-Onconase感染Sf9細(xì)胞，分別收集感染24 h、48 h和72 h后的Sf9細(xì)胞；細(xì)胞超聲裂解后，通過SDS-PAGE和Western blotting分析，可見大小約為11 kD的特異性蛋白條帶，表明AcNPV-Onconase在Sf9細(xì)胞中成功地表達(dá)了His-Onconase融合蛋白。
　　利用Ni-NTA agarose進(jìn)行變性純化，透析復(fù)性，實現(xiàn)原核表達(dá)His-Onconase的純

6、化、復(fù)性，SDS-PAGE和Western blotting結(jié)果顯示，成功獲得高純度的His-Onconase融合蛋白。
　　利用Ni-NTA agarose，在非變性的條件下純化真核表達(dá)的His-Onconase融合蛋白，SDS-PAGE和Western blotting結(jié)果顯示，獲得高純度的His-Onconase融合蛋白。
　　綜上所述，本研究利用原核及真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了His-Onconase融合蛋白，并純化出了較高