基于納米材料和功能核酸的光學(xué)傳感新方法用于酶活性檢測(cè).pdf

1、近年來，生物傳感器因其靈敏度高、選擇性好、分析時(shí)間短、檢測(cè)成本低等特點(diǎn)，極大地推動(dòng)了醫(yī)學(xué)臨床診斷和藥物篩選的發(fā)展。光學(xué)檢測(cè)技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、無需分離、可以實(shí)現(xiàn)原位和實(shí)時(shí)活體測(cè)定等優(yōu)點(diǎn)，在建立生物傳感器方面正被越來越多的研究者所關(guān)注。此外，功能核酸和納米材料的發(fā)展為構(gòu)建用于各種分析對(duì)象的生物傳感技術(shù)提供了全新的設(shè)計(jì)思路和平臺(tái)。本論文基于當(dāng)前一些重要酶活性檢測(cè)及其相關(guān)藥物篩選中的研究熱點(diǎn)，重點(diǎn)探討如何提高檢測(cè)靈敏度、降低檢測(cè)成本等問題。將納

2、米材料、功能核酸的優(yōu)勢(shì)相結(jié)合，發(fā)展了一些光學(xué)檢測(cè)新技術(shù)用于堿性磷酸酯酶、多聚核苷激酶、腺苷脫氨酶、堿基切除修復(fù)酶等酶活性及其抑制劑的測(cè)定。和傳統(tǒng)方法相比，本論文所建立的檢測(cè)方法靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、分析成本低廉。同時(shí)還初步驗(yàn)證了這些方法的實(shí)用性。具體內(nèi)容如下:
　　 堿性磷酸酯酶(ALP)的測(cè)定在相關(guān)疾病的臨床診斷中具有重要作用。在第2章中，基于焦磷酸(PPi)對(duì)熒光銅納米粒子合成的抑制能力，以PPi為底物，建立了一種可在生理?xiàng)l件

3、下檢測(cè)ALP的無標(biāo)記信號(hào)增強(qiáng)型方法。PPi可以和Cu2+之間形成很強(qiáng)的絡(luò)合物，該絡(luò)合作用將妨礙CuNPs的合成，造成熒光信號(hào)的降低。利用ALP對(duì)PPi的水解，使得PPi與Cu2+之間的絡(luò)合不能發(fā)生。在dsDNA模板的存在下，通過抗壞血酸對(duì)Cu2+的還原，CuNPs可以被有效地合成，從而熒光恢復(fù)，并且其恢復(fù)能力和ALP濃度直接相關(guān)。該方法不需要任何標(biāo)記或者復(fù)雜的設(shè)計(jì)，操作簡(jiǎn)便，分析成本低。并且該方法具有較高的靈敏度，其檢測(cè)下限達(dá)到0.1

4、nM。此外，信號(hào)增強(qiáng)模式也為ALP的測(cè)定提供了較好的選擇性。同時(shí)，還利用所建立的方法研究了磷酸根對(duì)ALP酶活性的抑制情況。在復(fù)雜環(huán)境中，該檢測(cè)方法同樣表現(xiàn)出了良好的分析性能。血清樣品中的回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果令人滿意。
　　 多聚核苷激酶(PNK)對(duì)DNA的磷酸化修飾過程在DNA損傷修復(fù)、復(fù)制和重組中起著非常重要的作用。第3章中，利用雙鏈DNA模板法制備的熒光銅納米粒子(CuNPs)為信號(hào)指示劑，開發(fā)了一種無標(biāo)記熒光方法用于PNK酶活性

5、的測(cè)定。實(shí)驗(yàn)中，利用一段雙鏈DNA同時(shí)作為PNK的底物和CuNPs合成的模板。當(dāng)PNK作用之后，雙鏈DNA模板將被磷酸化，導(dǎo)致雙鏈DNA立即被λ核酸外切酶降解。由于缺少了CuNPs合成所需的雙鏈DNA模板，該降解過程將抑制CuNPs的形成，造成熒光信號(hào)的下降。該測(cè)定方法不需要對(duì)底物DNA進(jìn)行任何化學(xué)修飾或者復(fù)雜的序列設(shè)計(jì)，從而使整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便，成本低廉。并且該方法選擇性好，靈敏度高，其檢測(cè)下限為0.49 U/mL。同時(shí)該檢測(cè)方法在復(fù)雜

6、體系中也具有較好的分析性能。
　　 腺苷脫氨酶(ADA)活性的測(cè)定及其抑制劑的篩選在臨床診斷中具有重要意義。第4章中，以腺苷脫氨酶為模型分析物，將氧化石墨烯對(duì)不同構(gòu)象核酸吸附能力的差異和核酸適配體對(duì)目標(biāo)識(shí)別的高特異性相結(jié)合，并利用SYBR greenⅠ作為熒光指示劑，構(gòu)建了一種基于氧化石墨烯-適配體平臺(tái)的無標(biāo)記高信背比熒光生物檢測(cè)方法。兩條劈開的適配體片段共同對(duì)腺苷的識(shí)別形成復(fù)合結(jié)構(gòu)，熒光染料將嵌入適配體/腺苷復(fù)合物的雙鏈區(qū)域。

7、并且復(fù)合結(jié)構(gòu)的形成也妨礙適配體片段在石墨烯表面的吸附，從而溶液具有較強(qiáng)的熒光信號(hào)。而腺苷脫氨酶對(duì)腺苷去氨基后，生成的次黃苷不能被適配體識(shí)別，適配體和熒光染料將吸附在石墨烯表面，導(dǎo)致熒光淬滅。該方法無需對(duì)適配體探針進(jìn)行化學(xué)修飾，易于合成制備，降低了分析成本。同時(shí)，氧化石墨烯的超強(qiáng)熒光淬滅能力也為該方法提供了較高的靈敏度，其檢測(cè)下限為0.025 U/mL。該方法為基于適配體的其他生物分子的檢測(cè)提供了一個(gè)參考手段。第5章中，基于酶調(diào)控納米金團(tuán)

8、聚策略，提出了一種無標(biāo)記可視化分析方法用于腺苷脫氨酶及其抑制劑的便捷靈敏測(cè)定。該方法主要依賴于腺嘌呤堿基環(huán)外氨基與納米金之間的強(qiáng)烈作用，從而置換出納米金表面弱結(jié)合的檸檬酸根離子，降低了納米金穩(wěn)定性，最終造成納米金的團(tuán)聚。而腺苷脫氨酶對(duì)腺苷的脫氨基反應(yīng)將抑制這個(gè)腺苷依賴的納米金團(tuán)聚現(xiàn)象。該方法無需其他輔助酶、核酸適配體或者化學(xué)修飾，使得整個(gè)測(cè)定過程簡(jiǎn)便、低成本，分析速度快，并實(shí)現(xiàn)了腺苷脫氨酶均相可視化檢測(cè)。該方法動(dòng)態(tài)范圍寬，靈敏度高，其線

9、性檢測(cè)范圍為0-15 U/L，檢測(cè)下限為0.8827 U/L。此外，該方法還實(shí)現(xiàn)了腺苷脫氨酶抑制劑的可視化篩選測(cè)定。
　　 堿基切除修復(fù)是DNA損傷修復(fù)過程中的重要途徑之一，其修復(fù)酶活性和多種疾病相關(guān)。在第6章中，以尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)為模型分析物，基于目標(biāo)激活自催化DNA酶信號(hào)放大策略，建立了兩種新型熒光分析方法用于堿基切除修復(fù)酶活性的測(cè)定。其基本思路是利用UDG的作用激活DNA酶，在輔助因子的存在下催化循環(huán)切割信

10、標(biāo)結(jié)構(gòu)的底物探針，對(duì)目標(biāo)的測(cè)定信號(hào)進(jìn)行放大。首先，基于UDG作用將降低其底物的熔鏈溫度這一特性，利用一條雙鏈DNA底物來構(gòu)建目標(biāo)激活自催化DNA酶策略。UDG的作用將使得DNA酶從雙鏈底物中釋放出去，從而激活DNA酶對(duì)信標(biāo)底物的催化循環(huán)切割。該方法具有較寬的動(dòng)態(tài)范圍和較高的靈敏度，其線性檢測(cè)范圍為0-1.0 U/mL，檢測(cè)下限為0.023 U/mL。并且，該方法也被成功用于UDG的抑制劑測(cè)定。其次，將滾環(huán)放大(RCA)反應(yīng)引入檢測(cè)體系構(gòu)