IL--32及其誘導(dǎo)的細(xì)胞因子在多發(fā)性骨髓瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景:
　　多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是起源于B細(xì)胞系的惡性血液系統(tǒng)疾病，以單克隆漿細(xì)胞的異常增生和異常免疫球蛋白的高表達(dá)為特征。MM與炎癥密切相關(guān)，有自身免疫性疾病史、感染病史以及其他炎癥性疾病史的患者中，其MM及MGUS發(fā)病率更高。目前認(rèn)為，炎性細(xì)胞、免疫細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子是骨髓微環(huán)境的主要組成部分。MM細(xì)胞能夠與其中骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone marrow stromalcells，BMSCs)相

2、互調(diào)節(jié)并“共進(jìn)化”，形成有利于MM的炎性微環(huán)境，從而誘導(dǎo)并促進(jìn)MM發(fā)生發(fā)展。BMSCs是MM微環(huán)境中白細(xì)胞介素6（interleukin6，IL-6）的主要來源，而IL-6又是MM細(xì)胞增殖最重要的細(xì)胞因子之一。但是反復(fù)的炎癥過程是如何促使骨髓微環(huán)境BMSCs分泌IL-6以及其他重要的炎癥因子的具體機(jī)制尚未完全闡明。
　　我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，MM患者血清中促炎因子白細(xì)胞介素32(interleukin32，IL-32)表達(dá)水平較健康

3、對照明顯增高。IL-32也被稱為自然殺傷因子4(nature killer4，NK-4)，是一類包含9種剪接變異體的細(xì)胞因子。多項證據(jù)顯示，IL-32呈現(xiàn)促炎癥因子的特性，能夠促進(jìn)IL-6，IL-1β，TNF-α等多種炎癥因子的分泌增加，并起到“級聯(lián)放大效應(yīng)”。也有研究表明，在實體腫瘤如胃癌、胰腺癌、腎細(xì)胞癌等中，IL-32呈高表達(dá)，并且被認(rèn)為是這些疾病的獨(dú)立不良預(yù)后因素。
　　本實驗旨在探索IL-32在調(diào)控MM骨髓微環(huán)境中細(xì)胞因

4、子中的作用及其分子機(jī)制，以及該網(wǎng)絡(luò)中各炎性因子的變化對MM細(xì)胞基因組不穩(wěn)定性、細(xì)胞增殖、凋亡等的影響。
　　目的:
　　1.進(jìn)一步明確IL-32在MM患者中的表達(dá)情況，并探究MM骨髓微環(huán)境中IL-32的主要來源;
　　2.研究IL-32誘導(dǎo)的MM骨髓微環(huán)境中細(xì)胞因子改變的具體情況，并通過構(gòu)建IL-32敲除的穩(wěn)轉(zhuǎn)MM細(xì)胞株多角度驗證其對細(xì)胞因子的調(diào)節(jié);
　　3.初步研究IL-32調(diào)節(jié)各種細(xì)胞因子釋放分泌的分子機(jī)制;

5、
　　4.探討IL-32對于MM細(xì)胞生物學(xué)功能（增殖、凋亡等）的作用。
　　方法:
　　1.ELISA檢測并對比MM患者與健康供者外周血及骨髓中IL-32的表達(dá)情況，免疫熒光、qPCR等手段檢測原代CD138-/CD138+細(xì)胞及MM細(xì)胞株中IL-32的表達(dá)情況;
　　2.以濃度梯度及時間梯度的方式，用重組人同源IL-32α(recombinant IL-32α，rIL-32α)刺激BMSCs，ELISA、細(xì)胞因

6、子陣列(cytokine array)等手段檢測其IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子的表達(dá)水平變化;通過短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）構(gòu)建IL-32敲除的MM細(xì)胞株，并將敲除或不敲除IL-32的MM細(xì)胞與BMSCs共培養(yǎng)，ELISA檢測其細(xì)胞因子表達(dá)水平的變化;
　　3.以濃度梯度及時間梯度的方式，用rIL-32α刺激BMSCs，Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)炎癥信號通路的活化水平;小干擾RNA（S

7、mall interfering RNA，siRNA）敲除BMSCs中蛋白酶3(Proteinase3，PR3)表達(dá)后，明確PR3在IL-32誘導(dǎo)激活炎癥信號通路中的作用;
　　4.CCK8檢測增殖，流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡，Western blot檢測DNA損傷效應(yīng)蛋白，明確IL-32直接或間接介導(dǎo)的MM細(xì)胞生物學(xué)功能的改變;NOD/SCID小鼠皮下成瘤，體內(nèi)驗證IL-32對小鼠腫瘤負(fù)荷的影響。
　　結(jié)果:
　　1.IL-

8、32在MM患者外周血及骨髓中的表達(dá)較健康供者顯著增高，免疫熒光、qPCR以及ELISA結(jié)果提示其主要來源于其MM患者骨髓中CD138+MM細(xì)胞。IL-32在MM細(xì)胞株中也廣泛表達(dá)，其中RPMI8226和OPM2相對高表達(dá)，H929、LP-1中相對低表達(dá);
　　2.rIL-32α能夠顯著促進(jìn)BMSCs中IL-6的表達(dá)，隨著其刺激濃度提升(20ng/mL，40ng/mL，80ng/mL and160ng/mL)，BMSCs釋放的IL-

9、6較正常情況下提高了3-8倍性;
　　3.RPMI8226細(xì)胞株能夠促進(jìn)BMSCs表達(dá)并分泌IL-6（360.8±28.4pg/mL vs177.3±9.4pg/mL，p＜0.05），而敲除IL-32的RPMI8226該效應(yīng)明顯減弱（246.7±10.9pg/mL vs360.8±28.4 pg/mL，p＜0.05）;在OPM2細(xì)胞株中也存在相同結(jié)果;
　　4.Cytokine array檢測發(fā)現(xiàn)，除IL-6外，rIL-32

10、α能夠調(diào)控BMSCs中多種炎癥因子、趨化因子的表達(dá)變化，MIP-1α和MIP-1β等的表達(dá)上升，此外，CCL-5，IL-10和VEGF等的表達(dá)下降;
　　5.rIL-32α的刺激能夠持續(xù)激活BMSCs中NF-κB和STAT3炎癥信號通路，加入該兩條信號通路抑制劑或者敲除BMSCs膜表面分子PR3后，減弱了rIL-32α刺激上述兩條信號通路的活化程度及IL-6的分泌;
　　6.rIL-32α直接刺激MM細(xì)胞株并未對其增殖、凋亡

11、產(chǎn)生變化;敲除MM細(xì)胞株中IL-32后對其增殖及凋亡的變化同樣沒有直接影響;
　　7.經(jīng)rIL-32α預(yù)處理的BMSCs條件培養(yǎng)基(BCCM)能夠顯著提升H929和LP-1細(xì)胞株的增殖;
　　8.BMSCs/MM細(xì)胞株共培養(yǎng)體系中，IL-32的缺失使得BMSCs對RPMI8226和OPM2細(xì)胞株的促增殖效應(yīng)減弱;在小鼠皮下成瘤實驗中，IL-32在腫瘤微環(huán)境中的缺失也使腫瘤負(fù)荷明顯降低;
　　9.BMSCs誘導(dǎo)MM細(xì)胞株

12、中DNA損傷效應(yīng)蛋白γH2AX升高，MM細(xì)胞株IL-32的缺失減弱該效應(yīng)。
　　結(jié)論:
　　本項研究首次發(fā)現(xiàn)并明確IL-32及其受體PR3在MM骨髓微環(huán)境中的表達(dá)情況。IL-32主要來源于MM細(xì)胞，其可溶性成分通過與PR3相互作用，活化BMSCs中炎癥相關(guān)信號通路NF-κB和STAT3，調(diào)節(jié)MM骨髓微環(huán)境中IL-6、IL-10、CCL-5和VEGF等多種細(xì)胞因子的表達(dá)和釋放，從而進(jìn)一步促進(jìn)MM細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其基因組不穩(wěn)定性形