基于高通量測(cè)序技術(shù)的miRNA分析策略及數(shù)據(jù)挖掘研究.pdf

1、微小RNA,microRNA(miRNA),是一類長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的小分子非編碼RNA,廣泛存在于真核生物中,通過(guò)和靶基因mRNA堿基配對(duì)引導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex,RISC)降解mRNA或阻礙其翻譯,在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá),具有重要的生物學(xué)功能,參與細(xì)胞發(fā)育、增殖、分化、凋亡等一系列的重要生物學(xué)過(guò)程,尤其是一些miRNAs具有癌基因和抑癌基因的作用,在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中扮演著重

2、要的角色。高通量測(cè)序技術(shù)具有測(cè)序速度快、成本低、通量高等優(yōu)點(diǎn),廣泛應(yīng)用于miRNA研究。本論文基于高通量測(cè)序技術(shù)所產(chǎn)生的海量小RNA數(shù)據(jù),結(jié)合miRNA的生物學(xué)特點(diǎn),發(fā)展了一套實(shí)用的、系統(tǒng)的miRNA分析方法,包括引入在研究樣本中表達(dá)比較恒定的miRNA作為內(nèi)參照恒定miRNA表達(dá)譜,基于miRNA基因簇(miRNA genecluster)和miRNA基因家族(miRNA gene family)進(jìn)行表達(dá)譜分析,以及有效的校正常見的多

3、重匹配問題,充分利用測(cè)序資源追蹤pre-miRNA加工機(jī)制等。此外,結(jié)合高通量測(cè)序數(shù)據(jù)及miRNA的生物學(xué)功能開展數(shù)據(jù)挖掘研究,充分利用測(cè)序數(shù)據(jù)的高靈敏度及高通量特點(diǎn),針對(duì)多重的miRNA變體(miRNA variants,isomiRs)及3’端附加堿基事件,結(jié)合人孕婦不同程度先兆子癇患者胎盤組織的miRNA測(cè)序數(shù)據(jù),以發(fā)現(xiàn)isomiR表達(dá)模式及3’端修飾事件在人類疾病中的可能作用,同時(shí)也系統(tǒng)分析isomiR分布譜及3’端附加堿基現(xiàn)象

4、在miRNA gene cluster和family中的分布特點(diǎn),從而豐富miRNA的研究。最后,針對(duì)miRNA高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析中的一些現(xiàn)象,本論文也開展了跨物種進(jìn)化分析,試圖從進(jìn)化的角度揭示其內(nèi)在的聯(lián)系,以發(fā)現(xiàn)miRNA進(jìn)化趨勢(shì)及潛在的進(jìn)化暗示,為進(jìn)一步完善miRNA數(shù)據(jù)分析提供理論基礎(chǔ)。主要研究?jī)?nèi)容和成果如下:
　　 1.基于miRNA測(cè)序數(shù)據(jù)分析策略研究
　　 高通量測(cè)序技術(shù)在比較不同發(fā)育階段,不同組織及不同條件

5、下的miRNA表達(dá)譜方面得到了廣泛的應(yīng)用,尤其是針對(duì)人類不同疾病狀態(tài)相關(guān)的miRNA研究,一度成為該研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。如何通過(guò)測(cè)序數(shù)據(jù)還原體內(nèi)的相對(duì)表達(dá)水平是十分重要的,在一定程度上能夠有效的指導(dǎo)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的開展。研究表明一些miRNAs在研究樣本中的表達(dá)水平相對(duì)來(lái)說(shuō)是較為穩(wěn)定的,這些表達(dá)恒定的miRNAs可以作為內(nèi)源參照引入數(shù)據(jù)分析,即可達(dá)到最終數(shù)據(jù)深度分析中半定量的效果,以更有效的篩選miRNA差異表達(dá)譜。同時(shí),盡管miRNlA表達(dá)譜的

6、比較分析一度成為研究熱點(diǎn),但通常情況下并未結(jié)合miRNA在基因組上的分布位置及功能相近的miRNA基因家族進(jìn)行系統(tǒng)分析。比如一些miRNAs成簇的分布在基因組上,一些miRNAs因?yàn)樾蛄邢嗨贫M成功能相近的miRNA基因家族,以及這些miRNAs之間可能經(jīng)歷了復(fù)雜的進(jìn)化歷程等,都可以成為進(jìn)一步深度分析miRNA表達(dá)的重要指標(biāo)。因此,我們引入了基于miRNA gene cluster及序列相近的miRNA gene family作為表達(dá)標(biāo)

7、簽,結(jié)合在基因組中的分布特點(diǎn)以及進(jìn)化信息,全面分析不同類別的miRNAs在研究對(duì)象中的表達(dá)差異,以更具體地研究一類miRNAs在調(diào)控生物學(xué)過(guò)程中的作用機(jī)制。
　　 由于miRNA長(zhǎng)度僅為約22 nt,且由于pre-miRNA的不精確加工過(guò)程所產(chǎn)生的具有多樣的5’和3’端及長(zhǎng)度分布的isomiRs,短的測(cè)序片段極易匹配上不同的參考序列,即出現(xiàn)多重匹配(multiple mapping)或者交叉匹配(cross-mapping)問題

8、,同時(shí)潛在的測(cè)序錯(cuò)誤及在數(shù)據(jù)分析中允許的堿基錯(cuò)配,在一定程度上增加了多重匹配的可能性和復(fù)雜性,如何有效的處理并校正頻繁的多重匹配問題顯得異常重要。本論文基于SOLiD雙堿基編碼技術(shù),充分結(jié)合miRNA的生物學(xué)特點(diǎn),在顏色水平上結(jié)合錯(cuò)配的分布譜、錯(cuò)配位置的質(zhì)量值、候選位置的表達(dá)譜及候選位置側(cè)翼序列的表達(dá)譜等特征,為進(jìn)一步有效校正多重匹配問題提供理論依據(jù)。
　　 根據(jù)高通量測(cè)序技術(shù)的高靈敏度及所產(chǎn)生的海量數(shù)據(jù)等特點(diǎn),全面分析小RNA

9、測(cè)序數(shù)據(jù),尤其是結(jié)合較短的測(cè)序片段(如小于18 nt),充分利用這些被忽視的小RNA資源,追蹤pre-miRNA的代謝產(chǎn)物,并根據(jù)每個(gè)miRNA位點(diǎn)所產(chǎn)生的具有不同長(zhǎng)度,5’和3’端及不同表達(dá)豐度的小RNAs,分別基于它們的5’和3’端分歧開展特殊RNA的相對(duì)表達(dá)水平分析,以了解pre-miRNA加工機(jī)制,從而進(jìn)一步豐富miRNA研究。
　　 2.miRNA/isomiRs分布譜及表達(dá)模式分析
　　 基于新一代測(cè)序技術(shù)的

10、高通量及高靈敏度,即使表達(dá)豐度較低的miRNAs,也可能被檢測(cè)到,并由此發(fā)現(xiàn)多重的miRNA變體,即isomiRs。研究發(fā)現(xiàn),盡管大多miRNAs(尤其是表達(dá)豐富的miRNAs)都可以檢測(cè)到多種多樣的isomiRs,但是isomiR的種類和miRNA的表達(dá)水平之間并沒有嚴(yán)格的相關(guān)性。通常,每個(gè)miRNA位點(diǎn)可以產(chǎn)生1-3種豐富表達(dá)的isomiRs,而其它種類的isomiRs則具有較低的表達(dá)水平。這些豐富表達(dá)的isomiRs具有相同的5’

11、端及種子序列,僅僅在序列的3’端具有堿基移動(dòng)的現(xiàn)象,此結(jié)果表明了Drosha和Dicer酶在pre-miRNA上的優(yōu)勢(shì)加工位點(diǎn)集中在連續(xù)的1-3個(gè)堿基,在miRNA5’端的加工位點(diǎn)則集中在一個(gè)特定的位置。不同的miRNAs具有不同種類的isomiRs和多樣的表達(dá)模式,且該現(xiàn)象并不是隨機(jī)的,通常在不同物種中及不同組織中是穩(wěn)定的。此外,不同動(dòng)物物種中miRNAs序列的多樣性,與多重isomiRs現(xiàn)象非常相似,且很多其它物種的miRNAs序列

12、均可以作為豐富表達(dá)的人isomiRs序列被檢測(cè)到,表明不同物種可能選擇具有不同5’端或3’端以及長(zhǎng)度分布的miRNA序列以適應(yīng)復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境及物種進(jìn)化所需。
　　 miRNA的3’端附加現(xiàn)象廣泛存在于動(dòng)物和植物的miRNA中,比較常見的是3’端附加堿基為腺嘌呤。通過(guò)對(duì)孕婦患不同程度先兆子癇的胎盤組織樣本進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)3’端附加堿基現(xiàn)象非常普遍,尤其是附加的腺嘌呤,但是這些修飾的isomiRs僅表現(xiàn)出了較低水平的表達(dá)百分比(小于

13、15％)。盡管某些修飾的isomiR序列也具有較高的表達(dá)水平,但是在其相應(yīng)的miRNA位點(diǎn)卻不是優(yōu)勢(shì)表達(dá)的isomiR。基于最豐富表達(dá)isomiR和所有的isomiRs分別統(tǒng)計(jì)差異表達(dá)miRNA譜,發(fā)現(xiàn)具有一致的差異表達(dá)miRNAs。此外,我們也從isomiR水平上篩選了差異表達(dá)的修飾isomiRs。這些差異表達(dá)的miRNAs或者修飾isomiRs,通常出現(xiàn)在正常對(duì)照和患有先兆子癇樣本中,或者不同程度的先兆子癇樣本中。有趣的是,這些表達(dá)

14、差異的修飾isomiRs具有與其參考miRNAs相同的5’端及種子序列,根據(jù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證過(guò)的靶標(biāo)基因信息,通過(guò)功能富集分析發(fā)現(xiàn)這些miRNAs參與了特定的生物學(xué)過(guò)程。該研究表明多重的isomiRs,尤其是具有3’端附加堿基的isomiRs并不是pre-miRNA加工過(guò)程中的一個(gè)隨機(jī)事件,多樣性的isomiRs及其表達(dá)模式具有一定的功能暗示,可能參與了人類疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。
　　 基于miRNA gene cluster/famil

15、y的表達(dá)分析表明,miRNA成員之間的表達(dá)水平可能具有顯著的差異,尤其是在miRNA cluster中。盡管成簇分布的miRNAs可能共享一套調(diào)節(jié)序列而共轉(zhuǎn)錄,不一致的表達(dá)模式說(shuō)明了miRNA的動(dòng)態(tài)調(diào)控過(guò)程。但在同源miRNAs之間,很多miRNAs來(lái)自于相應(yīng)pre-miRNAs的相同的臂,甚至具有相同的長(zhǎng)度分布,這表明相似的miRNA成熟機(jī)制,也暗示著這些miRNAs之間的功能相關(guān)性。IsomiR分布譜及3’端附加事件在一些miRNA

16、cluster/family中表現(xiàn)了一致的分布模式,表明這些miRNAs之間具有相似的pre-miRNA加工過(guò)程及3’端附加機(jī)制,這可能源自于進(jìn)化過(guò)程中的保守性加工和修飾過(guò)程,而該過(guò)程貢獻(xiàn)于多個(gè)miRNAs水平上的共調(diào)控生物學(xué)過(guò)程,從而暗示了不同miRNAs之間的功能和進(jìn)化聯(lián)系。
　　 3.miRNA進(jìn)化分析
　　 多重匹配現(xiàn)象在分析miRNA高通量測(cè)序數(shù)據(jù)中廣泛存在。為了進(jìn)一步了解這一現(xiàn)象,我們系統(tǒng)分析了人己知的miR

17、NAs和pre-miRNAs,研究發(fā)現(xiàn)miRNAs可以同時(shí)精確地匹配上人其它的非編碼RNAs(ncRNAs,包括rRNAs,tRNAs,snoRNAs,snRNAs等),不同的pre-miRNAs,包括pre-miRNAs的反向互補(bǔ)鏈。結(jié)果表明,其它ncRNAs及pre-miRNAs的反義鏈的降解或者加工過(guò)程所產(chǎn)生的片段也會(huì)貢獻(xiàn)于miRNA的富集,甚至于一些miRNAs由于錯(cuò)誤的注釋是偽“miRNAs”。與典型miRNA長(zhǎng)度相比(通常為

18、～22 nt),這些能夠精確匹配上其它ncRNAs的miRNAs,通常具有較短的長(zhǎng)度分布(17-19 nt),較低的前體預(yù)測(cè)值,甚至被鑒定為假的pre-miRNAs結(jié)構(gòu)。顯著地,4.9%的人miRNAs能夠同時(shí)匹配上pre-miRNAs的反義鏈,表明同一個(gè)基因組位置的兩個(gè)鏈都有可能產(chǎn)生成熟的miRNAs,同時(shí)也暗示了一些潛在的miRNA前體序列。所有結(jié)果表明,多重匹配現(xiàn)象在miRNA研究中遠(yuǎn)比我們想象的復(fù)雜,pre-miRNAs和其它n

19、cRNAs之間的序列相似性以及特定pre-miRNAs的莖環(huán)結(jié)構(gòu),都提供了一定的進(jìn)化暗示,將進(jìn)一步豐富miRNA進(jìn)化及生源論。
　　 基于高通量測(cè)序技術(shù)的高靈敏性,我們能夠發(fā)現(xiàn)一些表達(dá)量非常豐富的miRNA*(miRNA star,miRNA passenger strand)。根據(jù)典型的miRNA生源論,miRNA*是無(wú)功能的且被降解的。研究表明,miRNA/miRNA*比率可能會(huì)在不同的發(fā)育階段有所改變,而這個(gè)改變可能預(yù)示著

20、miRNA*在特殊的發(fā)展階段中起著重要的作用。根據(jù)miRNA在跨物種分析中非常保守的特性,miRNA*的命運(yùn),或者作為非功能性的passenger strand被降解,或者作為潛在的功能性miRNA而發(fā)揮生物學(xué)功能,可能在復(fù)雜的跨物種進(jìn)化以及物種內(nèi)進(jìn)化過(guò)程中有所體現(xiàn)。因此,本論文開展了基于miRNA家族及單獨(dú)的miRNA基因在脊椎動(dòng)物中的進(jìn)化分析,結(jié)果表明miRNA*通常不像它們的miRNAs那么保守,具有多樣的分歧模式。miRNA*的

21、序列分歧主要來(lái)自于不同的物種,同源的miRNA基因以及多重拷貝的miRNA前體序列之間的分歧。但有些miRNA*序列也是十分進(jìn)化保守的,尤其是它們的5’端及種子序列。對(duì)于那些同時(shí)能夠產(chǎn)生成熟的miR-＃-5p和miR-＃-3p的miRNA前體來(lái)說(shuō),它們的5’和3’arms在不同物種中都是十分保守的。綜上,miRNA*的命運(yùn)在進(jìn)化歷程中是有所暗示的,十分保守的miRNA*序列可能是潛在的調(diào)控分子而貢獻(xiàn)于復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
　　 此外

22、,在漫長(zhǎng)的miRNA進(jìn)化歷程中,每種物種對(duì)miRNA種類的選擇以及序列及長(zhǎng)度的選擇也可能和該物種的特點(diǎn)緊密相關(guān)。通過(guò)系統(tǒng)分析miR-17及miR-124這兩個(gè)典型的miRNA家族,表明miRNA可以作為一個(gè)非常特殊的進(jìn)化標(biāo)簽來(lái)研究不同物種漫長(zhǎng)的進(jìn)化歷史,以及在物種內(nèi)所引入的復(fù)雜進(jìn)化歷程。盡管miRNA在不同物種中是保守的,但是不同miRNAs之間具有不同的進(jìn)化模式,miR-17家族具有較為復(fù)雜的進(jìn)化歷史,由5個(gè)同源miRNAs組成,主要