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文檔簡介
1、菊花(Chrysanthemum morifolium Ramat.)是典型的短日植物,其花芽分化和開花時間受光周期調(diào)控。目前對模式植物的開花調(diào)控路徑研究較為清楚,對菊花的成花分子機(jī)制了解較少。本研究發(fā)現(xiàn)菊花‘低溫神馬’(M)在短日照條件下(SD)比‘神馬’(WT)提前一周左右開花,并且能夠在長日條件下(LD)能夠形成花蕾。經(jīng)過序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記(SRAP)鑒定確定其為‘神馬’的芽變材料。本研究試圖通過對上述兩種材料在不同光周期
2、條件下花芽分化的樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析,研究該芽變材料的開花分子機(jī)制并挖掘優(yōu)異基因。
主要研究結(jié)果和結(jié)論如下:
1.通過RNA-seq數(shù)據(jù)分析,發(fā)現(xiàn)‘低溫神馬’的開花調(diào)控路徑。構(gòu)建了4個轉(zhuǎn)錄組cDNA文庫,‘低溫神馬’-長日照(M-LD)、‘神馬’-長日照(WT-LD)、‘低溫神馬’-短日照(M-SD)和‘神馬’-短日照(WT-SD)。通過對4個cDNA文庫進(jìn)行聚類分析,我們挖掘到許多差異轉(zhuǎn)錄基因(DTGs),涉及到
3、光周期途徑、年齡途徑、環(huán)境溫度途徑和自主途徑。在短日照條件下,兩個材料中與晝夜節(jié)律鐘相關(guān)的基因及CmFTL3顯著上調(diào),誘導(dǎo)花芽分化和開花;赤霉素信號途徑的主要調(diào)控基因GA2ox、GA20ox和GID1的轉(zhuǎn)錄水平也發(fā)生顯著差異。在長日照條件下,‘低溫神馬’中GA20ox和GID1表達(dá)水平顯著上調(diào),GA2ox表達(dá)下調(diào),從而誘導(dǎo)CmFTL1、CmFTL3和SOC1表達(dá)量增加,促進(jìn)花芽分化和開花;并且‘低溫神馬’的內(nèi)源GA含量顯著高于‘神馬’,
4、外源GA處理后,‘神馬’的表型與‘低溫神馬’相似。以上結(jié)果表明,長日條件下,GA在‘低溫神馬’的成花過程起重要調(diào)控作用,能夠促進(jìn)花芽分化。我們的研究表明,光周期途徑和赤霉素途徑共同調(diào)控菊花短日條件下的開花時間,其中赤霉素信號是一條輔助路徑。但是,在長日條件下,赤霉素信號路徑在花芽分化和開花中起主要作用。
2.CmEMF2基因的克隆與功能分析。
對DTGs進(jìn)行聚類分析,發(fā)現(xiàn)除了光周期路徑和赤霉素信號路徑的關(guān)鍵基因,其他
5、開花相關(guān)的重要基因,包括:AP1、EMF、SVP、SPL、FRI等,均發(fā)生顯著的轉(zhuǎn)錄差異。鑒于EMFs的功能在菊花中尚不清楚,本試驗利用PCR等技術(shù)驗證了菊花‘神馬’中兩個EMF2基因的開放閱讀框(ORF)序列,二者均含有VEFS-box保守結(jié)構(gòu)域,其中CmEMF2.1的ORF編碼627個氨基酸殘基,CmEMF2.2的ORF編碼616個氨基酸殘基,二者相似度為58.65%。蛋白序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明,CmEMF2.1和CmEMF2
6、.2蛋白與菜薊(Cynara cardunculus var.scolymus)的相似性最高,遺傳距離也最近。亞細(xì)胞定位分析結(jié)果顯示CmEMF2.1定位于細(xì)胞核。熒光定量結(jié)果表明,菊花中兩個CmEMF基因的表達(dá)具有組織特異性,均在葉片中表達(dá)量最高。在營養(yǎng)生長階段,CmEMFs的表達(dá)量隨植株生長而增加,在花芽分化前達(dá)到峰值,花芽分化完成后,表達(dá)水平下降,但仍有一定的表達(dá)水平。我們猜測,CmEMFs能夠促進(jìn)菊花的營養(yǎng)生長,抑制生殖生長,而且
7、參與菊花的花器官發(fā)育。另外,CmEMF2.1能夠響應(yīng)光周期信號,在光照下表達(dá)量減少,在黑暗中表達(dá)量增加,猜測與不同光照下的轉(zhuǎn)錄活性有關(guān)。
3.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的菊花葉片瞬時轉(zhuǎn)化再生體系的構(gòu)建。
本研究通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時轉(zhuǎn)化法將含有GUS基因的表達(dá)載體pORER1-2×35S∶GUS轉(zhuǎn)入菊花‘優(yōu)香’葉片,經(jīng)過外植體消毒和組織培養(yǎng)獲得穩(wěn)定遺傳的陽性再生植株,轉(zhuǎn)化率為38.9%,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化法,為菊花提供了一種
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