基于高通量測(cè)序分析菊花花期芽變‘神馬’的成花機(jī)制及優(yōu)異基因挖掘.pdf

1、菊花（Chrysanthemum morifolium Ramat.）是典型的短日植物，其花芽分化和開(kāi)花時(shí)間受光周期調(diào)控。目前對(duì)模式植物的開(kāi)花調(diào)控路徑研究較為清楚，對(duì)菊花的成花分子機(jī)制了解較少。本研究發(fā)現(xiàn)菊花‘低溫神馬’(M)在短日照條件下(SD)比‘神馬’(WT)提前一周左右開(kāi)花，并且能夠在長(zhǎng)日條件下(LD)能夠形成花蕾。經(jīng)過(guò)序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記(SRAP)鑒定確定其為‘神馬’的芽變材料。本研究試圖通過(guò)對(duì)上述兩種材料在不同光周期

2、條件下花芽分化的樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，研究該芽變材料的開(kāi)花分子機(jī)制并挖掘優(yōu)異基因。
　　主要研究結(jié)果和結(jié)論如下:
　　1.通過(guò)RNA-seq數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)‘低溫神馬’的開(kāi)花調(diào)控路徑。構(gòu)建了4個(gè)轉(zhuǎn)錄組cDNA文庫(kù)，‘低溫神馬’-長(zhǎng)日照(M-LD)、‘神馬’-長(zhǎng)日照(WT-LD)、‘低溫神馬’-短日照(M-SD)和‘神馬’-短日照(WT-SD)。通過(guò)對(duì)4個(gè)cDNA文庫(kù)進(jìn)行聚類分析，我們挖掘到許多差異轉(zhuǎn)錄基因(DTGs)，涉及到

3、光周期途徑、年齡途徑、環(huán)境溫度途徑和自主途徑。在短日照條件下，兩個(gè)材料中與晝夜節(jié)律鐘相關(guān)的基因及CmFTL3顯著上調(diào)，誘導(dǎo)花芽分化和開(kāi)花;赤霉素信號(hào)途徑的主要調(diào)控基因GA2ox、GA20ox和GID1的轉(zhuǎn)錄水平也發(fā)生顯著差異。在長(zhǎng)日照條件下，‘低溫神馬’中GA20ox和GID1表達(dá)水平顯著上調(diào)，GA2ox表達(dá)下調(diào)，從而誘導(dǎo)CmFTL1、CmFTL3和SOC1表達(dá)量增加，促進(jìn)花芽分化和開(kāi)花;并且‘低溫神馬’的內(nèi)源GA含量顯著高于‘神馬’，

4、外源GA處理后，‘神馬’的表型與‘低溫神馬’相似。以上結(jié)果表明，長(zhǎng)日條件下，GA在‘低溫神馬’的成花過(guò)程起重要調(diào)控作用，能夠促進(jìn)花芽分化。我們的研究表明，光周期途徑和赤霉素途徑共同調(diào)控菊花短日條件下的開(kāi)花時(shí)間，其中赤霉素信號(hào)是一條輔助路徑。但是，在長(zhǎng)日條件下，赤霉素信號(hào)路徑在花芽分化和開(kāi)花中起主要作用。
　　2.CmEMF2基因的克隆與功能分析。
　　對(duì)DTGs進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)除了光周期路徑和赤霉素信號(hào)路徑的關(guān)鍵基因，其他

5、開(kāi)花相關(guān)的重要基因，包括:AP1、EMF、SVP、SPL、FRI等，均發(fā)生顯著的轉(zhuǎn)錄差異。鑒于EMFs的功能在菊花中尚不清楚，本試驗(yàn)利用PCR等技術(shù)驗(yàn)證了菊花‘神馬’中兩個(gè)EMF2基因的開(kāi)放閱讀框(ORF)序列，二者均含有VEFS-box保守結(jié)構(gòu)域，其中CmEMF2.1的ORF編碼627個(gè)氨基酸殘基，CmEMF2.2的ORF編碼616個(gè)氨基酸殘基，二者相似度為58.65％。蛋白序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，CmEMF2.1和CmEMF2

6、.2蛋白與菜薊（Cynara cardunculus var.scolymus）的相似性最高，遺傳距離也最近。亞細(xì)胞定位分析結(jié)果顯示CmEMF2.1定位于細(xì)胞核。熒光定量結(jié)果表明，菊花中兩個(gè)CmEMF基因的表達(dá)具有組織特異性，均在葉片中表達(dá)量最高。在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段，CmEMFs的表達(dá)量隨植株生長(zhǎng)而增加，在花芽分化前達(dá)到峰值，花芽分化完成后，表達(dá)水平下降，但仍有一定的表達(dá)水平。我們猜測(cè)，CmEMFs能夠促進(jìn)菊花的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，抑制生殖生長(zhǎng)，而且

7、參與菊花的花器官發(fā)育。另外，CmEMF2.1能夠響應(yīng)光周期信號(hào)，在光照下表達(dá)量減少，在黑暗中表達(dá)量增加，猜測(cè)與不同光照下的轉(zhuǎn)錄活性有關(guān)。
　　3.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的菊花葉片瞬時(shí)轉(zhuǎn)化再生體系的構(gòu)建。
　　本研究通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化法將含有GUS基因的表達(dá)載體pORER1-2×35S∶GUS轉(zhuǎn)入菊花‘優(yōu)香’葉片，經(jīng)過(guò)外植體消毒和組織培養(yǎng)獲得穩(wěn)定遺傳的陽(yáng)性再生植株，轉(zhuǎn)化率為38.9％，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化法，為菊花提供了一種