兩株真菌的次生代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定及生物學(xué)活性研究.pdf

1、從天然產(chǎn)物中篩選藥物先導(dǎo)化合物一直是新藥開發(fā)的重要思路。而真菌則一直是臨床小分子藥物的重要來源，臨床藥物中，青霉素、頭孢菌素等抗生素、他汀類降血脂藥物等，均產(chǎn)生自真菌。近些年，為了進(jìn)一步獲得微生物新藥的多樣性，科研人員不斷地?cái)U(kuò)大藥源真菌的來源，特別是加強(qiáng)來源于極端環(huán)境的真菌的活性篩選，以期從中尋找到結(jié)構(gòu)新穎、活性強(qiáng)的代謝產(chǎn)物。本課題即是在這種背景下展開的。
　　研究目的：①尋找極地來源的藥源真菌，獲取活性菌株；②對(duì)活性菌株進(jìn)行次級(jí)

2、代謝產(chǎn)物研究，重點(diǎn)尋找結(jié)構(gòu)新穎、生物學(xué)活性強(qiáng)的代謝產(chǎn)物。
　　為達(dá)到上述目的，我們需確定有活性的極地真菌菌株后進(jìn)行規(guī)模發(fā)酵，累積活性菌株的初提物的量以供分離鑒定真菌代謝產(chǎn)物化合物單體;然后開展對(duì)活性真菌的系統(tǒng)的化學(xué)成分研究;獲取化合物單體后，開展針對(duì)病死率高的惡性腫瘤和藥物體內(nèi)靶標(biāo)蛋白的活性評(píng)價(jià)工作，以明確極地藥源活性真菌的主要藥效成分及作用強(qiáng)度。這些工作，對(duì)于系統(tǒng)地闡明極地真菌中藥源真菌的藥效成分和化學(xué)多樣性，發(fā)現(xiàn)具有抗真菌及抗

3、腫瘤活性的新穎化學(xué)結(jié)構(gòu)有重要意義。
　　研究方法:首先對(duì)極地真菌樣品進(jìn)行小量發(fā)酵，獲取初提物浸膏，對(duì)初提物浸膏展開生物學(xué)活性初篩，獲取活性菌株。初篩采用紙片法進(jìn)行抗菌活性實(shí)驗(yàn)，采用微量液基稀釋法進(jìn)行抗真菌活性實(shí)驗(yàn)以及采用MTT法進(jìn)行體外細(xì)胞毒活性實(shí)驗(yàn)。確定活性菌株后，對(duì)活性菌株進(jìn)行發(fā)酵和代謝產(chǎn)物分離工作，通過分析核磁共振譜、質(zhì)譜圖結(jié)合文獻(xiàn)比對(duì)，確定化合物結(jié)構(gòu)。再采用生物分子相互作用分析儀尋找化合物的體內(nèi)靶標(biāo)蛋白，再根據(jù)有結(jié)合的靶標(biāo)

4、蛋白的生物學(xué)作用進(jìn)行免疫抑制活性測(cè)試。
　　研究結(jié)果:①78株極地真菌的生物學(xué)活性初篩結(jié)果表明，有15株真菌表現(xiàn)出抑菌活性，占19.23％; D-1，Z1-1，W-1-18，S-1-10，S-1-16，S-1-19和S-1-17-Z1菌株活性較強(qiáng)，可分別抑制多株指示菌株的生長(zhǎng);40株菌株表現(xiàn)出稻瘟霉生長(zhǎng)抑制作用，占到所篩選菌株的51.28％;其中，最大稀釋倍數(shù)在128倍及以上的有12株，占15.38％;抗人類致病真菌篩選結(jié)果只獲得

5、1株活性菌株，即B-13;另外，有24株菌株表現(xiàn)出細(xì)胞毒活性，占到總篩選菌株的30.77％。抑制活性表現(xiàn)最突出的是S-3-88和S-3-62，在50μg/mL濃度下，S-3-88菌株初提物對(duì)MCF，HeLa，H446，A549，SW1990和SGC7901細(xì)胞的抑制率分別為78.79％，76.20％，50.38％，45.90％，53.18％和74.66％;同樣濃度下，S-3-62菌株初提物對(duì)這6種腫瘤細(xì)胞株的抑制率分別為70.90％，6

6、9.8％，43.58％，40.64％，46.30％和35.96％。所有活性菌株中，具有2種或2種以上生物學(xué)活性的有4株菌，分別是D-1，B-13，S-1-10和S-1-16。
　?、趶臉O地Nectria sp.B-13的初提物浸膏中分離并鑒定了12個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)，分別是ilicicolin C（化合物1），LL-Z1272ε（化合物2），deacetylchloronectrin(化合物3)，dimethoxyilicicolin

7、 C（化合物4），ilicicolin D（化合物5），ilicicolin F（化合物6），ilicicolin E（化合物7），collectochlorin B（化合物8），ilicicolin A(化合物9)，ilicicolin H（化合物10），3，5-二羥基甲苯（化合物11）和3，5-二羥基苯甲醇（化合物12）.其中，化合物4是新化合物。
　?、蹚臉O地Eutypella sp.D-1的初提物浸膏中分離并鑒定了7個(gè)化合

8、物結(jié)構(gòu)，分別是麥角甾醇（化合物13），α-亞麻酸(化合物14)，脫氫松香酸（化合物15），LibertellenoneB（化合物16），eutypenoidA（化合物17），eutypenoid D（化合物18）和eutypenoidE（化合物19）。其中化合物18和19是新化合物，屬于海松烷型二萜。eutypenoid E的結(jié)構(gòu)較為特殊，其在C-11有羰基取代，和一般的海松烷型二萜不同，屬于變異的海松烷型二萜結(jié)構(gòu)。
　　④對(duì)化合

9、物進(jìn)行細(xì)胞毒活性研究表明，化合物6，7和9具有抑制淋巴細(xì)胞白血病Jurkat細(xì)胞增殖的作用，10μM濃度下，抑制率分別為59.27％，73.97％和71.43％。
　　⑤生物分子相互作用分析儀研究結(jié)果表明，化合物3，7和8能與蛋白FKBP12（FK506 binding protein12）結(jié)合，其結(jié)合常數(shù)Ka分別為7.85，220和7.47×104（陽性對(duì)照為8.03×104），化合物8的結(jié)合常數(shù)與陽性對(duì)照相當(dāng);解離常數(shù)Kd分別

10、為1.01×10-5，0.026和4.17×10-6(陽性對(duì)照為1.4×10-3);平均解離常數(shù)分別為1.28×10-6，1.18×10-4和5.58×10-11（陽性對(duì)照為1.75×10-8），說明化合物8與FKBP12蛋白的親和力高于陽性對(duì)照雷帕霉素，提示化合物8有可能具有類似于雷帕霉素的免疫抑制作用。然而，從接下來的免疫抑制活性研究中我們發(fā)現(xiàn)，所有測(cè)試的化合物僅有微弱的免疫抑制作用，提示化合物與蛋白FKBP12的結(jié)合并不影響B(tài)細(xì)胞

11、和T細(xì)胞的增殖，可能與FKBP12其他的生理功能相關(guān)?；衔?的免疫抑制活性稍強(qiáng)，可能與其細(xì)胞毒性有關(guān)。
　　研究結(jié)論:通過對(duì)極地真菌菌株的篩選，獲得了一批活性菌株;通過對(duì)2株活性菌株代謝產(chǎn)物的分離鑒定，獲得了19個(gè)極地真菌來源天然產(chǎn)物，其中有3個(gè)新化合物。生物學(xué)活性研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)化合物8與FKBP12蛋白結(jié)合的親和力高于陽性對(duì)照。以上研究提供了一批新穎結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性的極地真菌天然產(chǎn)物，也發(fā)現(xiàn)了化合物8的體內(nèi)結(jié)合蛋白，為進(jìn)一步開發(fā)