五株真菌次級代謝產物的結構和生物活性研究.pdf

1、本論文以不同生源環(huán)境分離得到的海洋和陸生真菌作為研究對象，開展活性次級代謝產物的結構和生物活性研究。研究主要內容包括：活性菌株的分離篩選；代謝產物的分離純化及化學結構的鑒定和構型的確定；新化合物生合成途徑的探索；單體化合物生物活性的初步評價；活性化合物作用靶點和活性機制的初步探討。 從采集自不同緯度(山東、福建、廣東、海南)的24個潮間帶海泥、紅樹林根泥和火山口沉積物樣品中共分離絲狀真菌390株，采用海蝦生物致死法和tsFt21

2、0細胞鏡檢細胞毒活性篩選模型，結合TLC及HPLC化學篩選，得到20株活性菌，從中選取火山口沉積物來源的桔青霉Penicillium citrinum HGY1-5和紅樹林根部海泥來源的灰綠曲霉Aspergillus glaucus HB1-19，以及其他來源的三株真菌-深海海泥來源的青霉Penicillium sp.F23-2和青霉Penicillium sp.F1，潮間帶海泥來源的木霉Trichoderma sp.f-13-作為本論

3、文的研究對象。 對5株目標活性菌株發(fā)酵產物運用萃取，薄層色譜，正相、反相硅膠柱色譜，LH-20凝膠柱色譜，反相高壓液相等化學分離純化手段，從桔青霉P.citrinumHGY1-5的代謝產物中分離得到47個單體化合物(1-47)；從灰綠曲霉A.glaucusHB1-19的代謝產物中分離得到了34個單體化合物(42，43，48-79)；從青霉Penicillium sp.F23-2的代謝產物中分離得到11個單體化合物(80-90)；

4、從青霉Penicillium sp.F1的代謝產物中分離得到了10個單體化合物(91-100)；從木霉Trichoderma sp.f-13的代謝產物中分離得到了11個單體化合物(46，101-110)；另外，以桔青霉P.citrinum HGY1-5對甾體進行生物轉化得到三個單體化合物(111-113)；對桔霉素二聚體17的化學轉化得到一個人工產物(114)，共114個化合物。 繼而，利用理化性質和波譜學方法(IR，UV，MS

5、，NMR.，CD，X-ray)結合化學反應的方法(Mosher法，對溴苯甲酰酯化等)闡明了全部114個化合物的化學結構(Fig.1)，結構類型按生合成來源分類包括：甾體類化合物21個(1-16，40，41，111-113)，萜類化合物6個(85-90)，聚酮類化合物56個(17-39，42-45，48-75，114)，生物堿類化合物19個(76-84，91-100)，sorbicillin衍生物11個(46，101-110)，腦苷酯類化

6、合物1個(47)。其中發(fā)現(xiàn)新化合物63個，包括13個具有罕見的bicyclo[4.4.1]A/B環(huán)的C25甾體化合物(1，3-13，16)，2個新骨架的桔霉素三聚體(19，20)，13個結構新穎的桔霉素二聚體(17，18，21-24，26-28，32-34，114)，2個含有新穎的naphtho[1，2，3-de]chromene-2，7-dione骨架的灰綠霉素類聚酮化合物(48，49)，2個含有新穎的spiro[5.5]undeca

7、ne螺環(huán)骨架的灰綠霉素類聚酮化合物(50，51)，14個蒽型的或萘型的芳香聚酮化合物(52-54，56，57，59-61，63-68)，2個meleagrin型生物堿(80，81，其中80是一個新穎的meleagrin型生物堿與conidiogenone型二萜鏈接形成的復合化合物)，2個roquefortine型二酮哌嗪生物堿(83，84)，6個罕見的conidiogenone型二萜(85-90，目前僅兩例報道)，5個brevicomp

8、anine型二酮哌嗪生物堿(91-93，96，97)，2個sorbicillin衍生物(101，107)。在研究中，我們首次采用穩(wěn)定同位素標記，化學結構轉化和甾體微生物轉化的方法確定了C25甾體(1-16)骨架的生合成來源和各側鏈類型化合物的親緣關系；我們對桔霉素(36)人工聚合和降解反應機制進行了探索研究；采用X-ray單晶衍射方法確定了新骨架化合物灰綠霉素A(48)的結構，采用同位素標記結合NMR的方法確定了螺環(huán)新骨架化合物灰綠霉素

9、C(50)的結構，并進一步采用在線手性HPLC-CD和計算機量子化學CD模擬相結合的方法，確定了灰綠霉素C外消旋混合物的本質及兩個對映異構體的絕對構型；采用NOESY和CD相結合的方法首次確定了conidiogenone型二萜(85-90)的絕對構型；采用NOESY和氨基酸手性HPLC分析相結合的方法確定了brevicompanine型二酮哌嗪生物堿(91-93，96，97)的絕對構型。 為了尋找化合物的治療作用，我們采用抗腫瘤

10、和神經保護兩種不同的策略對單體化合物的生物活性進行評價。首先，采用MTT法、SRB法以及流式細胞術結合形態(tài)學檢測的方法，對分離獲得的單體化合物的抗腫瘤活性進行了初步評價，從中篩選出了20個活性化合物(細胞毒IC50＜10μM)(17-22，24，46，48，49，61，80-82，86.88，90，102，114)，進一步采用ELESA和Western blot等方法對活性化合物的分子靶點和作用機制進行初步探索。其中：1.新骨架化合物灰

11、綠霉素A(48)對A-549和HL-60細胞的IC50分別為0.13和0.28μM；該化合物在10μM時對蛋白激酶具有抑制作用，抑制率分別為Src(40.5％)，KDR(43.4％)；在該濃度下灰綠霉素A(48)還可以明顯的抑制拓撲異構酶Ⅱ的活性；初步的實驗表明灰綠霉素A(48)對小鼠S180肉瘤模型具有體內抗腫瘤活性；目前對灰綠霉素A(48)的臨床前藥效學評價正在深入進行當中。2.桔霉素聚合物17-20和114在1-10μM濃度下可以

12、明顯的誘導HL-60細胞發(fā)生凋亡，其作用具有時間依賴性和濃度依賴性；它們在10μM濃度下可以效應性的激活凋亡相關蛋白Caspase3和8以及PARP，是一類新穎的腫瘤細胞凋亡誘導劑。3.Meleagrin生物堿82在10μM濃度下可以將HL-60細胞周期阻滯在G2/M期，推測其作用機制可能與其9-OCHa類似物oxaline一樣，通過抑制微管蛋白聚合發(fā)揮作用；而生物堿與二萜鏈接型新骨架化合物meleagrin B(80)在10μM和5μ

13、M濃度下可以明顯的誘導HL-60細胞發(fā)生凋亡，推測二萜片斷的引入可能使其作用靶點發(fā)生了改變。4.Sorbicillin衍生物(46，101-110)對HL-60細胞的細胞毒測試表明，山梨?；鶄孺?，3-雙鍵還原會使相應的化合物細胞毒活性下降2-10倍，說明此類化合物側鏈共軛系統(tǒng)與其抗腫瘤活性密切相關。 對于100μM濃度下沒有表現(xiàn)出明顯的細胞毒活性的化合物，采用LPS誘導的BV2小膠質細胞炎癥拮抗模型或G-蛋白偶聯(lián)受體12(GP

14、R12)激活模型評測其潛在的神經保護活性，首次發(fā)現(xiàn)10個新活性化合物(1，2，8，9，12，91，92，94，96，97)。其中：1.Brevicompanine型二酮哌嗪生物堿92和97在0.1μg/ml～80μg/ml濃度范圍內對LPS誘導的BV2小膠質細胞炎癥模型具有明顯的抑制活性，這是首次發(fā)現(xiàn)此類二酮哌嗪生物堿的抗炎活性。2.C25甾體化合物1，2，8，9和12在10μM濃度下可以明顯的激活GPR12，促進cAMP的釋放。這是首

15、次發(fā)現(xiàn)C25甾體化合物潛在的治療活性。 本論文從5株真菌次級代謝產物中共分離鑒定了63個新化合物，發(fā)現(xiàn)了五種新穎的化合物骨架類型，確定了其絕對構型，并對C25甾體，桔霉素衍生物和灰綠霉素類聚酮等新骨架化合物的生合成進行了系統(tǒng)的研究，豐富了天然產物的化學結構類型和生合成內容。經活性評價，共篩選出30個活性化合物(包括24個新化合物)，其中發(fā)現(xiàn)了一個新骨架的抗腫瘤先導化合物灰綠霉素A(48)，該化合物具有新穎的naphtho[1，2

16、，3-de]chromene-2，7-dione骨架，體外細胞和分子水平有效，體內初步評價有效，是一個新穎的多靶點作用的抗腫瘤先導化合物；發(fā)現(xiàn)了兩類新骨架的腫瘤凋亡誘導劑桔霉素聚合物17-20和生物堿與二萜鏈接型化合物meleagrin B(80)，為新藥研究提供了重要的先導結構。共分離篩選獲得20株抗腫瘤活性菌株，發(fā)現(xiàn)了三株能產生系列新骨架抗腫瘤活性化合物的真菌灰綠曲霉A.glaucus HB1-19，桔青霉P.citrinum HG