兩種藥用植物內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物及其生物活性的研究.pdf

1、植物內(nèi)生真菌是具有高度多樣性的微生物資源，代謝產(chǎn)物多種多樣，目前被認(rèn)為是抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、殺蟲(chóng)等天然活性物質(zhì)的重要資源。為了尋找更多的生物活性物質(zhì)，本論文采用活性追蹤的方法，研究了4株來(lái)源于藥用植物的內(nèi)生真菌的活性代謝產(chǎn)物。內(nèi)容包括：藥用植物（杜仲和無(wú)花果）內(nèi)生真菌的分離的初步鑒定；抗菌活性菌株的分級(jí)組合篩選；活性菌株的鑒定和發(fā)酵條件考察；活性成分的追蹤分離；單體化合物的結(jié)構(gòu)解析；單體化合物生物活性的初步評(píng)價(jià)。概括如下:

2、r>　　（1）以杜仲和無(wú)花果為研究對(duì)象，共獲得了119株內(nèi)生真菌。從杜仲根、莖、葉中分離得到62株內(nèi)生真菌，初步形態(tài)學(xué)鑒定，這些內(nèi)生真菌分屬于7目，9科，15屬，其中曲霉屬Aspergillus sp.，鐮孢霉屬Fusrium sp.，鏈格孢屬 Alternaria sp.是杜仲內(nèi)生真菌的優(yōu)勢(shì)種群。從無(wú)花果根、莖、葉中分離得到57株內(nèi)生真菌，初步形態(tài)學(xué)鑒定，分屬于7目，10科，21屬。其中鐮孢霉屬Fusrium sp.，青霉屬Penic

3、illium sp.，曲霉屬Aspergillus sp.是無(wú)花果內(nèi)生真菌的優(yōu)勢(shì)種屬。不同部位分離內(nèi)生真菌的數(shù)量、種類和分布不盡相同，這就表明這兩種藥用植物的不同部位內(nèi)生真菌的數(shù)量、分布和種群存在差異。
　?。?）采用抗菌活性篩選為主、代謝產(chǎn)物化學(xué)成分篩選為輔的二級(jí)組合篩選模式，得到如下結(jié)果：抗菌活性初篩確定活性菌株共有20株（杜仲內(nèi)生真菌11株，無(wú)花果內(nèi)生真菌9株），篩選率為16.8％；抗菌活性復(fù)篩篩選到12株高抗菌活性的內(nèi)生真

4、菌，篩選率為10.1%；結(jié)合化學(xué)成分復(fù)篩最后確定了ER12、EL09、FR02、FL10這4株具有高抗菌活性，并且代謝產(chǎn)物種類豐富的內(nèi)生真菌作為本論文的研究對(duì)象。
　　（3）根據(jù)菌株的形態(tài)、培養(yǎng)特征、18S rDNA以及ITS序列分析結(jié)果，對(duì)活性菌株ER12、EL09、FR02和FL10進(jìn)行菌種鑒定，分別鑒定為刀孢蠟蚧菌、黑曲霉、溜曲霉以及三線鐮孢。以菌絲體生物量、發(fā)酵產(chǎn)物重量、抗菌活性、薄層色譜分析以及高效液相色譜分析為評(píng)價(jià)依據(jù)

5、，對(duì)4株活性內(nèi)生真菌進(jìn)行了發(fā)酵產(chǎn)物穩(wěn)定性試驗(yàn)，培養(yǎng)基選擇試驗(yàn)，發(fā)酵時(shí)間試驗(yàn)，萃取實(shí)驗(yàn)，確定了4株活性內(nèi)生真菌的擴(kuò)大培養(yǎng)條件以及提取條件。
　?。?）經(jīng)過(guò)擴(kuò)大培養(yǎng)，采用常規(guī)的硅膠柱層析、反相硅膠柱層析，凝膠Sephadex LH-20柱層析、制備薄層層析以及重結(jié)晶等分離手段，從4株活性內(nèi)生真菌分離到90個(gè)單體化合物。利用各種現(xiàn)代波譜技術(shù)（EI-MS、HR-ESI-MS、1H-NMR、13C-NMR、DEPT、1H-1HCOSY、HS

6、QC、HMBC等）并結(jié)合化學(xué)方法鑒定了這90個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)，其中新化合物3個(gè)，分別是malformin E（19）、cyclo-(N-methyl-Trp-Leu)（62）和helovlic acid ester（83）。
　　從ER12中分離到34個(gè)化合物，其代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)類型是12個(gè)環(huán)二肽類化合物（3-10，13-16），1個(gè)新的環(huán)五肽化合物（19），4個(gè)fumiquinazoline生物堿類化合物（17，18，22，23），

7、2個(gè)二苯酮類化合物（20，21），1個(gè)咪唑類化合物（12），2個(gè)甾體化合物（1，2），8個(gè)苯的衍生物（11，24-28，31，32）及4個(gè)核酸苷（29，30，33，34）。從EL09中分離到18個(gè)化合物，其代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)類型是9個(gè)甾體類化合物（38-44,1,2），3個(gè)脂肪酸（35-37），2個(gè)呋喃類化合物（45，46），2個(gè)多羥基醇化合物（47，48）及2個(gè)吲哚類化合物（49，50）。從FR02中分離到22個(gè)化合物，其代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)類

8、型是13個(gè)吲哚二酮哌嗪類化合物（53-65，其中62為新化合物，65為新天然產(chǎn)物），2個(gè)萜類化合物（51，52），2個(gè)甾體化合物（1，39），2個(gè)多元羧酸（67，68）和1個(gè)多元醇（66）。從FL10中分離到33個(gè)化合物，其代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)類型是7個(gè)gliotoxin類化合物（74-80），3個(gè)煙曲霉酸的衍生物（81-83），3個(gè)環(huán)二肽化合物（13，14，84），5個(gè)脂肪酸（69-71，36，37），4個(gè)甾體化合物（1，39，72，73）

9、，3個(gè)苯的衍生物（87-89），4個(gè)堿基或核酸苷（29，30，85，86）及4個(gè)多元羧酸或多元醇（47，48，68，90）。
　?。?）采用MIC法，以11種指示菌（4個(gè)細(xì)菌和7個(gè)植物病原真菌）為模型，對(duì)4株活性內(nèi)生真菌產(chǎn)生的90個(gè)單體化合物進(jìn)行抑菌活性評(píng)價(jià)，結(jié)果表明有26個(gè)化合物對(duì)指示菌顯示了較強(qiáng)的抑制作用。新化合物19（malformin E）和83（helovlic acid ester）對(duì)多種指示菌表現(xiàn)了很強(qiáng)的抗菌作用。綜

10、合分析抗菌活性測(cè)試的結(jié)果，明確了4株活性內(nèi)生真菌生物活性物質(zhì)的類別，ER12 Lecanicillium psalliotae的活性物質(zhì)主要是fumiquinazoline類生物堿和環(huán)肽類化合物；EL09Aspergillus niger的活性物質(zhì)主要是甾醇類和呋喃類化合物；FR02 Aspergillus tamarii的活性物質(zhì)主要是吲哚二酮哌嗪生物堿類化合物；FL10 Fusarium tricinctumi的活性物質(zhì)主要是gli

11、otoxin類生物堿和煙曲霉酸類化合物。
　　采用MTT法，以3個(gè)腫瘤細(xì)胞株（MCF-7人乳腺癌細(xì)胞、HepG2人肝癌細(xì)胞、A549人肺癌細(xì)胞）為模型，對(duì)分離得到的新化合物和生物堿類代謝產(chǎn)物的抗腫瘤活性進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)，結(jié)果表明這些化合物對(duì)不同腫瘤細(xì)胞系表現(xiàn)出不同程度的增殖抑制活性。其中新化合物malformin E（19）MCF-7和HepG2系表現(xiàn)出很好的細(xì)胞毒活性，IC50分別是0.65和2.42μM；fumiquinazol

12、ine C（18）和fumiquinazoline J（23）對(duì)HepG2和A549腫瘤細(xì)胞的增殖有抑制作用，verruculogen（56）對(duì)HepG2和A549腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出很強(qiáng)的細(xì)胞毒性，IC50分別是1.95和2.56μM。
　　總之，本文經(jīng)過(guò)篩選獲得4株活性內(nèi)生真菌，通過(guò)分離鑒定闡明了4株內(nèi)生真菌中90個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)，其中包括3個(gè)新化合物。評(píng)價(jià)了這些單體化合物的抗菌活性和抗腫瘤活性，發(fā)現(xiàn)了26個(gè)單體化合物具有較強(qiáng)抗菌活性