百草枯檢測新方法及百草枯在小鼠體內(nèi)死后再分布和死后彌散研究.pdf

1、百草枯又名克蕪蹤、對草快，化學(xué)名是1，1-二甲基-4，4聯(lián)吡啶陽離子鹽，分子式為C12H14N2·2Cl，分子量為257.2Da，是目前全世界廣泛使用的有機雜環(huán)類接觸性脫葉劑，具有觸殺作用和一定內(nèi)吸作用。純品為白色結(jié)晶，以陽離子形式存在，易溶于水，微溶于乙醇和丙酮，在酸中穩(wěn)定存在，在堿中易被分解，常用制劑為20％的水溶液。口服中毒死亡率可達90％以上，目前已被20多個國家禁止或者嚴格限制使用。
　　 百草枯對哺乳動物具有較強的毒

2、性，尤其是人。目前也沒有特效藥可以解毒，口服中毒死亡率可達90％以上。據(jù)報道，每年在亞洲、美洲、歐洲都有大量的百草枯死亡案例出現(xiàn)，已報告的死亡病例達數(shù)百例，多是經(jīng)口誤服致死。
　　 百草枯可通過消化道、受損的皮膚等途徑進人體，中毒后死亡率高，尤其以肺部最為突出，此外還對全身其他臟器造成嚴重損傷。大腦作為神經(jīng)中樞部位，對毒物反應(yīng)極為敏感。百草枯對哺乳動物腦組織中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)存在的危害，為探討其神經(jīng)毒性提供了試驗素材。
　　

3、 百草枯可以引起多臟器的損傷，尤其是肺部最為明顯。肺部損傷主要表現(xiàn)形式為肺水腫、肺泡出血、炎癥細胞侵潤、膠原沉積和成纖維細胞增生等。早期患者在中毒幾天內(nèi)死于急性呼吸窘迫綜合征和多臟器功能的衰竭。即使早期存活的患者也會因肺間質(zhì)纖維化在數(shù)周內(nèi)死亡，個別幸存病人也由于肺間質(zhì)的纖維化其生存質(zhì)量嚴重下降。
　　 基于上述原因，本實驗研究首先建立了兩種檢測百草枯的新方法，又將小鼠作為動物模型，研究了百草枯在其體內(nèi)的死后分布、死后再分布和死

4、后彌散現(xiàn)象，觀察了中毒小鼠血液及腦中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的變化情況。
　　 第一部分，除草劑百草枯測定方法的建立
　　 (1)毛細管電泳—紫外檢測法測定血清中百草枯方法的建立
　　 目的:建立一種準確、簡便、快速的方法用于測定百草枯的含量。
　　 方法:將商品除草劑直接稀釋后上樣;血清中的百草枯則需要C18固相萃取后上樣，在256nm紫外波長處測定百草枯的含量。毛細管電泳法采用重力進樣，進樣高度25cm，進樣時

5、間15s，彈性石英毛細管內(nèi)徑75μm，有效分離長度55cm，分離電壓12kV，以濃度20mmol/L，pH3.5的NaH2PO4緩沖溶液，1.0mmol/L的十二烷基硫酸鈉(SDS)作為電泳緩沖液進行分離。
　　 結(jié)果:毛細管電泳—紫外檢測法測得百草枯線性范圍為0.02～5.00μg/ml，線性回歸方程A=36977c-517，相關(guān)系數(shù)0.9984。平行進樣7次，其RSD為4.52％，計算所得百草枯的檢出限為3.0ng/ml。測

6、得除草劑中百草枯的實際含量是182.1g/L。將百草枯實際樣品稀釋2×105倍過濾后，加入0.02，1.00，2.50μg/ml的標準品測得PQ的回收率分別為96.7％，90.1％，95.6％，平均回收率為94.1％，平均RSD為2.17％。向血清中分別加入上述PQ的標準品固相萃取后，測得其回收率分別為85.0％，88.0％，82.0％，平均回收率為85.0％，平均RSD為4.79％。
　　 小結(jié):毛細管電泳紫外檢測法測定除草劑

7、中百草枯的含量方法準確可靠，結(jié)果令人滿意。
　　 (2)修飾電極—電化學(xué)法測定除草劑中百草枯的含量
　　 目的:研究百草枯在番紅花紅/金納米/DNA修飾的玻碳電極的電化學(xué)行為，并用于實際樣品的測定，從而建立一種準確、簡便、快速的方法用于測定百草枯的含量。
　　 方法:(1)修飾電極的制備:將裸玻碳電極置于Al2O3粉末的懸漿之中進行打磨至鏡面，取出，依次用1∶1的丙酮、1∶1的硝酸、二次蒸餾水，各超聲清洗5分鐘，

8、氮氣吹干。
　　 (2)條件選擇:找出SFR聚合最佳濃度、SFR最佳聚合圈數(shù)、金納米浸泡最佳時間、DNA浸泡最佳時間和緩沖液最佳pH值。
　　 (3)在最佳條件下，利用差分脈沖法測定不同濃度百草枯在修飾電極上的線性關(guān)系。
　　 (4)在2×10-4mol/L百草枯溶液中，考察修飾膜的穩(wěn)定性及干擾物對其測定時的影響。
　　 (5)利用SFR/Au/DNA聚合膜電極對百草枯樣品進行了測定，將其稀釋至所在范圍濃

9、度，在最佳條件下用差分脈沖法進行測定。
　　 結(jié)果:(1)條件選擇:SFR的最佳濃度為2mmol/L;SFR的最佳聚合圈數(shù)為30圈;金納米修飾時間為8h;DNA修飾時間為4h;緩沖溶液最佳pH為7.0;
　　 (2)利用修飾電極，電化學(xué)檢測法測得百草枯線性范圍為1.0×10-5～1.0×10-3mol/L，線性回歸方程H=5.5921c+0.2537，相關(guān)系數(shù)R2=0.9957。平行測定11次，其RSD為5.84％，計算

10、所得百草枯的檢出限為3.3×10-6mol/L。測得除草劑中百草枯的實際含量是183.6g/L。將百草枯實際樣品稀釋后，加入0.05，0.25，0.50mmol/L的標準品測得PQ的回收率分別為100.0％，97.4％，97.4％，平均回收率為98.3％;平均RSD為4.70％。
　　 小結(jié):發(fā)現(xiàn)SFR/Au/DNA聚合膜對于百草枯的還原能夠起到明顯的電催化作用，該電極已用于實際樣品測定，結(jié)果令人滿意。
　　 第二部分，

11、百草枯在小鼠體內(nèi)的死后分布、死后再分布及死后彌散研究
　　 目的:(1)建立小鼠百草枯死后分布、埋葬尸體中的分解動力學(xué)及死后百草枯灌胃死后彌散的動物模型;
　　 (2)研究百草枯在小鼠體內(nèi)的死后分布及埋葬尸體中的分解動力學(xué);
　　 (3)研究百草枯在小鼠體內(nèi)的死后彌散現(xiàn)象。
　　 方法:(1)百草枯在埋葬尸體中的分解動力學(xué)研究
　　 ①取健康昆明小鼠28只，8LD50劑量百草枯灌胃染毒致死。0天的

12、死后立即解剖取材，其余裝入塑料袋，不封口，埋于河北醫(yī)科大學(xué)本部公共衛(wèi)生學(xué)院西面花園中。分別于21、42、63、84、105、126天后挖出，解剖取材，高效液相色譜法檢測其中百草枯的含量;②取健康昆明小鼠8只，8LD50劑量百草枯灌胃染毒致死，死后隨機分成2組，分別裝于木箱和編織袋中，埋于花園中，63天后挖出解剖取材，檢測其中百草枯的含量;③取健康昆明小鼠8只，以同樣劑量處死后，分別于2012.3.3與2012.5.5埋葬，63天后（即2

13、012.5.5及2012.7.7）挖出;解剖取材，檢測百草枯的含量。
　　 (2)百草枯在小鼠體內(nèi)的死后彌散研究
　　 ①將小鼠脊椎脫臼處死，1小時后，4LD50百草枯灌胃，將染毒的小鼠置于常溫環(huán)境下(20℃)，分別于6、12、24、48、72、96h各解剖4只小鼠，取心、腎、腦、肺、右下肢肌肉，血液。將小鼠的肝臟分為四個部分，分別是:(Ⅰ)肝左葉;(Ⅱ)肝中間部分;(Ⅲ)肝右葉;(Ⅳ)肝基底部位。稱重，測其百草枯的含量

14、;②將小鼠脊椎脫臼處死，1小時后，4LD50百草枯灌胃，將染毒的小鼠分別置于4℃和-20℃，72h后解剖，取心、肝、腎、腦、肺、右下肢肌肉，血液，稱重，測其百草枯的含量;③將小鼠脊椎脫臼處死，1小時后，以2LD50和8LD50百草枯灌胃，將染毒的小鼠置于20℃，72h后解剖動物，取心、肝、腎、腦、肺、右下肢肌肉、血液，稱量，測其百草枯的含量。
　　 結(jié)果:(1)百草枯在小鼠體內(nèi)的死后分布:中毒小鼠死亡后體內(nèi)各個組織都檢測出百草枯

15、，其中胃＞腸＞腎＞肝＞脾＞肺＞血液＞右下肢肌肉＞腦＞心;
　　 (2)埋葬尸體中百草枯隨時間變化:8LD50灌胃致死小鼠埋葬尸體中PQ的含量呈現(xiàn)先上升，后下降的趨勢。埋葬42天后尸體心、肝、脾、肺、腎、胃、腸、腦、右下肢肌肉中百草枯含量升至最高，之后緩慢下降;
　　 (3)不同埋葬方式研究結(jié)果表明埋葬63天塑料袋包裝小鼠尸體心、肺、肝、腎、腦、肌肉中百草枯含量平均值均高于編織袋及木箱包裝，說明編織袋保存尸體中百草枯分解較

16、快，木箱次之，塑料袋最慢。
　　 (4)不同季節(jié)埋葬結(jié)果顯示:冬天埋葬的小鼠尸體心、肺、肝、腎、腦、肌肉中百草枯含量平均值均高于春天及夏天埋葬的小鼠;
　　 (5)死后6小時在小鼠體內(nèi)各臟器檢出百草枯，說明百草枯在死后尸體內(nèi)是可以發(fā)生彌散的。肝左葉是百草枯集中的地方，其百草枯濃度/百草枯血液濃度的比值最高，達到7.87±2.32。另外肝臟中四個不同區(qū)域的百草枯平均濃度分別是13.57、11.94、3.89和3.36μg/

17、g（肝左葉、肝基底部位、肝中間部位、肝右葉）。將每一只小鼠測定的不同組織中的百草枯濃度標出，并作出各個臟器的線性關(guān)系，其中:肝(R2=0.4565)、腎(R2=0.3882)、肺(R2=0.5414)、腦(R2=0.6846)、心(R2=0.6600)、右下肢肌肉(R2=0.4937);
　　 (6)不同儲存溫度結(jié)果顯示:72h后，20℃儲存的小鼠尸體中，心、肺、肝、腎、腦、右下肢肌肉中百草枯含量平均值均高于4℃及-20℃;

18、r>　　 (7)不同灌胃劑量結(jié)果顯示:8LD50灌胃劑量的小鼠尸體中心、肺、肝、腎、腦、右下肢肌肉中百草枯含量平均值均高于2LD50和4LD50。
　　 小結(jié):(1)本實驗分別采用8LD50和4LD50劑量百草枯灌胃染毒，建立了百草枯的死后分布和死后彌散模型，可應(yīng)用于百草枯中毒（死）的法醫(yī)學(xué)檢驗及法醫(yī)毒物動力學(xué)研究。
　　 (2)8LD50灌胃致死小鼠埋葬尸體中百草枯的含量呈現(xiàn)先上升，后下降的趨勢。埋葬42天后尸體心、

19、肝、脾、肺、腎、胃、腸、腦、右下肢肌肉中百草枯含量升至最高，之后緩慢下降。埋葬126天后，小鼠心、肝、脾、胃、腎、肺、腸、右下肢肌肉仍能檢測到百草枯;不同埋葬方式對中毒小鼠體內(nèi)百草枯的含量有一定影響，編織袋分解較快，木箱次之，塑料袋最慢;埋葬季節(jié)對中毒小鼠體內(nèi)百草枯的含量也有影響，冬天溫度低，百草枯分解較慢;夏天溫度高，百草枯分解較快。
　　 (3)小鼠死后1小時4LD50百草枯灌胃后，6h后可在其各個臟器中檢測到百草枯，說明百

20、草枯在小鼠體內(nèi)可發(fā)生死后彌散。從肝臟四個部分可以看出，離胃越近的部分，彌散的濃度越大。這與百草枯本身的理化性質(zhì)、染毒劑量、尸體保存溫度及時間、彌散距離和尸體的姿勢有關(guān)。
　　 (4)在百草枯中毒死亡埋葬尸體法醫(yī)學(xué)鑒定時，應(yīng)根據(jù)埋葬時間、埋葬方式、埋葬季節(jié)、服毒劑量等因素對尸體中百草枯分解的影響，結(jié)合中毒方式和生前搶救情況，及早進行尸體挖掘和檢驗，全面取材，大致推斷埋葬當時尸體中百草枯的含量范圍。除了要提取胃內(nèi)容物、肺、心血等常見

21、的檢材外，還應(yīng)當采取腎，肝，脾，腦等組織進行定性、定量分析，并充分考慮毒物的劑量、死亡時間、尸體所處的環(huán)境、體內(nèi)微生物等影響因素，結(jié)合臨床表現(xiàn)、病理報告等綜合分析，為百草枯誤服案件、中毒死亡案件和死后灌毒案件的甄別提供科學(xué)客觀的依據(jù)。
　　 第三部分，單胺類神經(jīng)遞質(zhì)在百草枯中毒小鼠血、腦組織中的變化研究
　　 目的:(1)建立單胺類神經(jīng)遞質(zhì)在小鼠血液和腦中的檢測方法;
　　 (2)研究百草枯中毒小鼠血液和腦中單胺

22、類神經(jīng)遞質(zhì)含量的變化情況。
　　 方法:(1)條件優(yōu)化:本研究采用高效液相色譜—庫侖陣列電化學(xué)檢測器(HPLC-ECD)對小鼠血液及腦組織中的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的檢測方法進行了系統(tǒng)研究。通過對樣品的前處理方法的改進，對檢測電極電勢的選擇和流動相條件的優(yōu)化，確定了小鼠血液及腦組織中神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的含量的檢測條件。
　　 (2)動物實驗:對照組:健康雄性昆明小鼠，40～45g;中毒組:將健康昆明小鼠以10mg/

23、kg灌胃后，分別于1、3、7、14、21天斷頭處死，解剖（解剖前注入肝素，以防血液凝固），取心血、腦。小鼠血液前處理用固相萃取;小鼠腦組織樣品直接用5％的磺基水楊酸處理，取50μl直接進入HPLC進行檢測。
　　 結(jié)果:(1)條件優(yōu)化:
　　 ①檢測小鼠血液中兒茶酚胺的色譜條件為:流動相緩沖液為20mmol/L檸檬酸三鈉，用HCl調(diào)pH為3.25，經(jīng)0.22μm的濾膜過濾后加11％(v/v)的甲醇，應(yīng)用前經(jīng)超聲脫氣，流速

24、為0.5ml/min，柱溫保持25℃，電化學(xué)檢測器電壓設(shè)置為0.85V。在此條件下，NE、E、DA在0.5～40ng/ml呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，檢出限依次為0.4、0.4、0.2ng/ml，回收率為89.0％～100.0％，日內(nèi)及日間RSD均小于6％。
　　 ②檢測小鼠腦中神經(jīng)遞質(zhì)的色譜條件為:流動相緩沖液為20mmol/L檸檬酸三鈉，HCl調(diào)pH4.25，經(jīng)0.22μm的濾膜過濾后加10％(v/v)的甲醇，應(yīng)用前經(jīng)超聲脫氣，流速

25、為1.0ml/min，柱溫保持25℃，電化學(xué)檢測器電壓設(shè)置為0.75V。在此條件下，DA、MHPG、5-HT、DOPAC、5-HIAA、HVA在10～1000ng/ml呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其檢出限為依次為0.2、0.4、0.1、0.4、0.1、0.3ng/ml，六種神經(jīng)遞質(zhì)的回收率在86.6％～94.5％，日內(nèi)及日間RSD均小于5％。
　　 (2)動物實驗:
　　 ①正常及中毒組小鼠血液中兒茶酚胺類物質(zhì)的測定:中毒后小鼠

26、的兒茶酚胺含量比正常組的平均值低，到21天后，中毒小鼠血液中的NE、E、DA分別是正常組的53％、73％和40％，達到了極顯著差異(P＜0.01)。
　　 ②正常及中毒組小鼠腦組織中六種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的測定:中毒后小腦中的神經(jīng)遞質(zhì)含量比正常組的平均值低，到21天后，中毒小鼠腦中的DA、DOPAC、HVA、MHPG、5-HT、5-HIAA分別是正常組的77％、82％、58％、85％、81％和84％，DA達到了顯著差異(P＜0.05

27、)，其余五組達到了極顯著差異（P＜0.01）。
　　 小結(jié):(1)本文對所建立的方法均進行了周密的驗證，結(jié)果顯示此方法準確、靈敏，操作簡單，方便快捷，適宜生物樣品的檢測;
　　 (2)NE、E、DA、DOPAC、5-HT、5-HIAA、MHPG及HVA都是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，在神經(jīng)信號的傳遞中發(fā)揮重要作用，實驗結(jié)果表明百草枯可導(dǎo)致小鼠血液中兒茶酚胺及腦組織中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量減少，影響神經(jīng)興奮的傳遞，對小鼠神經(jīng)

28、系統(tǒng)具有一定的毒性作用。
　　 結(jié)論:本研究建立了兩種檢測除草劑百草枯的新方法(CE-UV，ECD)，并分別與傳統(tǒng)經(jīng)典高效液相方法做了對比，發(fā)現(xiàn)其檢測結(jié)果準確，檢測范圍較寬，能滿足實際樣品的測定需要，可以在法醫(yī)毒物分析中進行應(yīng)用。
　　 創(chuàng)建了百草枯急性中毒的小鼠模型，在此基礎(chǔ)上對百草枯在小鼠體內(nèi)的死后分布、死后再分布及死后彌散進行了一系列的研究，發(fā)現(xiàn)8LD50灌胃致死小鼠埋葬尸體中百草枯的含量先上升，后下降，在42天達

29、到極值;埋葬126天后，小鼠各個臟器仍能檢測到百草枯。小鼠死后1小時4LD50百草枯灌胃后，6h后可在其各個臟器檢測到百草枯，說明其在小鼠體內(nèi)可以發(fā)生死后彌散，且離胃越近的部位，彌散的濃度越大。
　　 建立了單胺類神經(jīng)遞質(zhì)在小鼠血液和腦中的檢測方法，并且研究了百草枯中毒前后小鼠血液和腦中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)(NE、E、DA、DOPAC、5-HT、5-HIAA、MHPG及HVA)含量的變化情況，結(jié)果顯示百草枯可導(dǎo)致小鼠血液中兒茶酚胺及腦