甲基叔丁基醚細(xì)胞毒性作用的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、甲基叔丁基醚（methyl tert-butyl ether,MTBE）作為一類廣泛應(yīng)用于汽油添加劑的有機(jī)小分子，近年來的職業(yè)暴露和環(huán)境暴露日益增多。研究表明甲基叔丁基醚在細(xì)胞水平及整體動(dòng)物水平對(duì)生物體產(chǎn)生毒性作用，其潛在的毒性和生物學(xué)效應(yīng)包括急性毒性、生殖毒性、遺傳毒性、致癌性、細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激等，但其毒性作用機(jī)制不明。本研究結(jié)合毒理學(xué)研究方法和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，探討MTBE誘導(dǎo)中國倉鼠卵巢（Chinese hamster ovary

2、,CHO）細(xì)胞的氧化應(yīng)激效應(yīng)和蛋白質(zhì)組的改變，在分子水平探討MTBE的潛在毒性作用。
　　本論文主要開展了以下兩部分的研究工作：
　　1.MTBE對(duì)CHO細(xì)胞的體外毒性作用及氧化應(yīng)激效應(yīng)
　　培養(yǎng)CHO細(xì)胞，使用不同濃度（0～100mmol/L）的MTBE處理CHO細(xì)胞6h、12h、24h，MTT法觀察細(xì)胞的增殖抑制作用，確定MTBE作用CHO細(xì)胞劑量-效應(yīng)關(guān)系。設(shè)置空白對(duì)照組，以0.5mmol/L、5.0mmol/L

3、、25.0mmol/L、50.0mmol/L和100mmol/L為處理組，處理時(shí)間均為12h，用試劑盒檢測乳酸脫氫酶（LDH）漏出、丙二醛（MDA）含量、活性氧（ROS）生成量及超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）活力等氧化應(yīng)激相關(guān)各項(xiàng)指標(biāo)，同時(shí)運(yùn)用熒光定量PCR和Western blot技術(shù)檢測氧化應(yīng)激相關(guān)基因和蛋白表達(dá)水平。
　　研究發(fā)現(xiàn)：處理后的CHO細(xì)胞，其存活率下降，并呈劑量

4、-效應(yīng)關(guān)系；同時(shí)LDH漏出，MDA含量都隨MTBE劑量的增大而升高，且呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系，但ROS生成量卻隨MTBE劑量的增大而降低，SOD、CAT及GSH酶活力都呈升高趨勢。此外，隨著MTBE濃度的升高，SOD1、CAT、GPX-1的基因和蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組相比都有不同程度的升高。這一結(jié)果也與前期的相關(guān)酶活力的變化趨勢呈現(xiàn)很好的一致性。因此，MTBE暴露可以抑制CHO細(xì)胞增殖并引起氧化應(yīng)激效應(yīng)，提示氧化應(yīng)激效應(yīng)可能參與MTBE致CH

5、O細(xì)胞的毒性作用。
　　2.MTBE致CHO細(xì)胞毒性作用的蛋白質(zhì)組學(xué)研究
　　參考確定的劑量-效應(yīng)關(guān)系，MTBE暴露以0mmol/L、5.0mmol/L和100.0mmol/L3個(gè)劑量對(duì)CHO細(xì)胞進(jìn)行12h處理，制備蛋白樣品進(jìn)行熒光差異凝膠電泳（2D-DIGE），對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜鑒定并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，再使用Western blot對(duì)差異蛋白進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。
　　研究發(fā)現(xiàn)：通過2D-

6、DIGE和MALDI-TOF-MS/MS質(zhì)譜技術(shù)，測定了在MTBE處理下CHO細(xì)胞蛋白質(zhì)組的差異表達(dá)，共鑒定出24個(gè)蛋白，與對(duì)照組相比，有16個(gè)蛋白的表達(dá)上調(diào)，8個(gè)蛋白的表達(dá)下調(diào)。對(duì)這些差異蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，篩選出4個(gè)與細(xì)胞毒性以及氧化應(yīng)激相關(guān)的蛋白分子，分別為：Stress-70 protein,mitochondrial（GRP75）、Heat shock cognate71 kDa protein（HSC70）、40S ri