甲基叔丁基醚細胞毒性作用的蛋白質組學研究.pdf

1、甲基叔丁基醚（methyl tert-butyl ether,MTBE）作為一類廣泛應用于汽油添加劑的有機小分子，近年來的職業(yè)暴露和環(huán)境暴露日益增多。研究表明甲基叔丁基醚在細胞水平及整體動物水平對生物體產生毒性作用，其潛在的毒性和生物學效應包括急性毒性、生殖毒性、遺傳毒性、致癌性、細胞凋亡及氧化應激等，但其毒性作用機制不明。本研究結合毒理學研究方法和蛋白質組學技術，探討MTBE誘導中國倉鼠卵巢（Chinese hamster ovary

2、,CHO）細胞的氧化應激效應和蛋白質組的改變，在分子水平探討MTBE的潛在毒性作用。
　　本論文主要開展了以下兩部分的研究工作：
　　1.MTBE對CHO細胞的體外毒性作用及氧化應激效應
　　培養(yǎng)CHO細胞，使用不同濃度（0～100mmol/L）的MTBE處理CHO細胞6h、12h、24h，MTT法觀察細胞的增殖抑制作用，確定MTBE作用CHO細胞劑量-效應關系。設置空白對照組，以0.5mmol/L、5.0mmol/L

3、、25.0mmol/L、50.0mmol/L和100mmol/L為處理組，處理時間均為12h，用試劑盒檢測乳酸脫氫酶（LDH）漏出、丙二醛（MDA）含量、活性氧（ROS）生成量及超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）活力等氧化應激相關各項指標，同時運用熒光定量PCR和Western blot技術檢測氧化應激相關基因和蛋白表達水平。
　　研究發(fā)現：處理后的CHO細胞，其存活率下降，并呈劑量

4、-效應關系；同時LDH漏出，MDA含量都隨MTBE劑量的增大而升高，且呈現劑量-效應關系，但ROS生成量卻隨MTBE劑量的增大而降低，SOD、CAT及GSH酶活力都呈升高趨勢。此外，隨著MTBE濃度的升高，SOD1、CAT、GPX-1的基因和蛋白表達水平與對照組相比都有不同程度的升高。這一結果也與前期的相關酶活力的變化趨勢呈現很好的一致性。因此，MTBE暴露可以抑制CHO細胞增殖并引起氧化應激效應，提示氧化應激效應可能參與MTBE致CH

5、O細胞的毒性作用。
　　2.MTBE致CHO細胞毒性作用的蛋白質組學研究
　　參考確定的劑量-效應關系，MTBE暴露以0mmol/L、5.0mmol/L和100.0mmol/L3個劑量對CHO細胞進行12h處理，制備蛋白樣品進行熒光差異凝膠電泳（2D-DIGE），對差異表達蛋白進行MALDI-TOF-TOF質譜鑒定并進行生物信息學分析，再使用Western blot對差異蛋白進行進一步的驗證。
　　研究發(fā)現：通過2D-

6、DIGE和MALDI-TOF-MS/MS質譜技術，測定了在MTBE處理下CHO細胞蛋白質組的差異表達，共鑒定出24個蛋白，與對照組相比，有16個蛋白的表達上調，8個蛋白的表達下調。對這些差異蛋白進行生物信息學分析，篩選出4個與細胞毒性以及氧化應激相關的蛋白分子，分別為：Stress-70 protein,mitochondrial（GRP75）、Heat shock cognate71 kDa protein（HSC70）、40S ri