微生物產(chǎn)角蛋白酶和彈性蛋白酶的應(yīng)用基礎(chǔ)研究.pdf

1、角蛋白(Keratin)是一種廣泛存在于自然界中的硬性蛋白，主要存在于各種動物的毛發(fā)、鱗片、羽毛、蹄、角等結(jié)構(gòu)中；彈性蛋白(Elastin)是結(jié)締組織，尤其腱和動脈等彈性組織中的一種主要的硬蛋白，這兩種蛋白化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不溶于水，也不能被一般的蛋白酶，如胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等水解。能夠水解這兩種蛋白的蛋白酶分別稱之為角蛋白酶和彈性蛋白酶。彈性蛋白酶作為一種藥物，主要由動物臟器提取，由于其來源的限制，使得這種酶的價錢非常昂貴，而

2、從微生物中純化的彈性蛋白酶活性很強，可以水解多種難降解的纖維蛋白，如角蛋白、彈性蛋白和膠原等，具有廣泛的應(yīng)用前景。
　　 本研究確定了一株可降解角蛋白和彈性蛋白的弗氏鏈霉菌菌株S-221(Streptomyces fradiae S-221)，并從中克隆到與降解角蛋白和彈性蛋白有關(guān)的基因sfks。該基因長度為924bp，編碼包括信號肽和前導(dǎo)肽在內(nèi)的307個氨基酸。氨基酸序列比對結(jié)果表明，該蛋白酶與灰色鏈霉菌(Streptomyc

3、es griseus)產(chǎn)生的鏈霉蛋白酶(Pronase)SGPA和SGPB有著比較高的氨基酸序列相似性，分別達到78％和62％，而鏈霉蛋白酶是一種工業(yè)上廣泛應(yīng)用的蛋白酶，主要應(yīng)用在洗衣粉添加劑中。早在1994年，日本科學(xué)家就從弗氏鏈霉菌ATCC14544中克隆到此蛋白酶的成熟蛋白部分的基因，但并沒有得到信號肽和前導(dǎo)肽序列；姚斌的課題組通過RT-PCR方法從弗氏鏈霉菌K11中克隆到了此基因的完整序列，并構(gòu)建了組成型和蔗糖誘導(dǎo)型分泌表達的枯

4、草芽孢桿菌表達系統(tǒng)，但由于其在異源宿主中前導(dǎo)肽無法得到高效的剪切，所以無法得到高活性的蛋白酶。
　　 本研究中分別將包括信號肽(sfks)和不包括信號肽(sfk)的基因克隆到大腸桿菌表達載體中，轉(zhuǎn)入E.coli BL21中進行誘導(dǎo)表達，改變各種誘導(dǎo)條件和培養(yǎng)條件都無法得到可溶性表達；將該基因克隆到含有融合標(biāo)簽的表達載體中進行融合表達，仍然得不到可溶性蛋白。同時通過SDS-PAGE檢測，無論是含有信號肽還是沒有信號肽，在大腸中表達

5、后都無法剪切前導(dǎo)肽，通過包含體的復(fù)性也無法得到有活性的蛋白。
　　 考慮到來源于不同宿主的基因?qū)γ艽a子的偏好性，以及宿主本身的內(nèi)環(huán)境對基因表達調(diào)控的影響，我們將該基因在鏈霉菌表達系統(tǒng)中進行表達。運用攜帶紅霉素抗性基因強啟動子PermE*的組成型強啟動子表達載體pIB139，和攜帶硫鏈絲菌素誘導(dǎo)啟動子PtipA的大腸桿菌一鏈霉菌穿梭載體pCJW93，通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、結(jié)合轉(zhuǎn)移方法將重組質(zhì)粒導(dǎo)入變鉛青鏈霉菌TK24(Streptom

6、yces lividansTK24)和FR008中，能夠?qū)崿F(xiàn)該基因的表達，但表達量都不高。我們以pHZ1358為模版，成功構(gòu)建了表達載體pJTU4881，將帶有信號肽的sfks基因克隆至該表達載體，轉(zhuǎn)入變鉛青鏈霉菌TK24后成功實現(xiàn)了該蛋白的高效表達，其表達量遠遠高于在上述兩種常用表達載體中的表達量。實驗表明，該重組蛋白有角蛋白酶和彈性蛋白酶活性，其在異源宿主中得產(chǎn)量遠遠高于弗氏鏈霉菌自身得分泌量。
　　 通過定點突變對該重組蛋