角蛋白酶高產(chǎn)菌株的選育及其產(chǎn)酶研究.pdf

1、家禽養(yǎng)殖場(chǎng)和屠宰場(chǎng)每年會(huì)產(chǎn)生幾萬(wàn)噸的羽毛廢棄物，這些羽毛廢棄物中含有豐富的且有價(jià)值的角蛋白和氨基酸，其主要成分是角蛋白。角蛋白巾含有豐富的二硫鍵，而使其在羽毛廢棄物很難被降解。微生物降解羽毛角蛋白目前已經(jīng)成為一個(gè)吸引人的方法，用于處理角蛋白廢棄物。
　　本試驗(yàn)從陜西省楊凌區(qū)崔西溝養(yǎng)雞場(chǎng)采集了樣本土樣，在以羽毛為唯一碳氮源的培養(yǎng)基中，共分離出13株細(xì)菌。對(duì)分離的菌株進(jìn)行16S rDNA PCR-RFLP分析，并對(duì)不同類群的代表菌株進(jìn)

2、行16S rDNA序列進(jìn)行測(cè)定和降解能力的測(cè)定，最終獲得1株對(duì)羽毛降解能力最強(qiáng)的菌株，該菌株能夠能在7天內(nèi)將10 g/L羽毛完全降解。通過(guò)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法鑒定，該菌株與節(jié)桿菌G2-1T(Arthrobacter nitroguajacolicus G2-1T)相似度最高(100％)，并結(jié)合生理生化，初步將該菌株鑒定為Arthrobacter sp.ZJT01。
　　對(duì)菌株ZJT01產(chǎn)角蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步的研究，結(jié)果表

3、明:菌株ZJT01最適發(fā)酵溫度是30℃，最適發(fā)酵時(shí)間為3天;粗酶液的最適pH為8，最適溫度是35℃;異丙醇、二甲基亞砜(DMSO)、CaCl2和KCl對(duì)角蛋白酶具有一定的抑制作用，MgCl2能夠促進(jìn)角蛋白酶的酶活。該角蛋白酶能夠被PMSF抑制，所以該角蛋白酶屬于絲氨酸類角蛋白酶。
　　為提高其角蛋白酶的活性，我們通過(guò)基因組改組的方法來(lái)獲得高產(chǎn)菌株。首先通過(guò)硫酸二乙酯(DES)和亞硝基胍(NTG)誘變獲得突變體庫(kù)，然后通過(guò)原生質(zhì)體融

4、合使多親本基因組發(fā)生重組，使角蛋白酶活性獲得提高。
　　通過(guò)DES和NTG對(duì)菌株ZJT01分別進(jìn)行誘變，確定了最佳的誘變條件。DES最適濃度為9μL/mL，誘變時(shí)間為20 min，NTG的最適合濃度是0.6 mg/mL，處理時(shí)間為15min。然后對(duì)突變株進(jìn)行篩篩選，經(jīng)過(guò)三輪誘變后得到了5個(gè)突變株，其角蛋白酶活性都有所增加，其角蛋白酶活分別為13.4 U/mL、15.5 U/mL、14.2 U/mL、15.7 U/mL、13U/mL

5、，相對(duì)原始菌株(10.6U/mL)提高了26.4％、46.2％、33.96％、48.1％、22.6％。
　　通過(guò)單因素試驗(yàn)研究了原生質(zhì)體制備的最適條件，結(jié)果表明:向菌懸液中加入10mg/mL溶菌酶，酶解溫度在37℃條件下酶解處理30 min，原生質(zhì)體形成率最高。以DES和NTG突變體為親本庫(kù)進(jìn)行原生質(zhì)體融合，通過(guò)篩選，三輪基因組改組后獲得6個(gè)突變菌株，其中F3-5和F3-6角蛋白酶活較高，分別為68.3 U/mL和68.7 U/m