海洋細菌Glaciecola mesophila KMM241產(chǎn)木聚糖酶的結(jié)構(gòu)、功能和應用潛力研究.pdf

1、海洋總面積占到地球面積70％以上，海水占到地球總水量的97％，因此海洋環(huán)境是地球生態(tài)環(huán)境的重要組成部分，海洋碳循環(huán)在地球生物圈碳循環(huán)中起到至關(guān)重要的作用。在海洋碳循環(huán)過程中，海洋微生物扮演著重要的角色，它們將海洋浮游植物和光合細菌通過光合作用儲存的有機碳重新分解，以二氧化碳的形式重新釋放到大氣圈中。木聚糖是一種最主要的半纖維素，是地球上僅次于纖維素的第二大碳源物質(zhì)，也是海洋環(huán)境中有機碳的重要組成部分。與纖維素相比，木聚糖結(jié)構(gòu)更為復雜，木

2、聚糖的完全降解需要多種酶類的協(xié)同作用。β-1，4-內(nèi)切木聚糖酶(EC3.2.1.8)能夠水解木聚糖主鏈的β-1，4-木糖苷鍵，在木聚糖的降解中起到關(guān)鍵作用，因此在整個海洋碳循環(huán)中也具有重要意義。海洋環(huán)境普遍具有高鹽，高流動性的特點，而深海區(qū)域（深度超過2000米）更是具有高壓，低溫，黑暗，寡營養(yǎng)等極端特征。海洋中的微生物為了適應海洋環(huán)境，進化出了許多與之相適應的特點，并且在其基因組中往往蘊含著許多有價值的基因資源。因此海洋不但是物種多樣

3、性的寶庫，也是基因的寶庫。對這些基因資源的序列分析和功能鑒定對于研究海洋生境中的許多生化過程具有重要理論意義。
　　 Glaciecola mesophila KMM 241是一株分離自海洋無脊椎動物的海洋細菌。我們的前期研究表明，該菌株能夠產(chǎn)生多種木聚糖酶，并且在前期研究中我們已經(jīng)對該菌株產(chǎn)生的一個屬于糖苷水解酶第十家族的木聚糖酶XynA進行了基因克隆和性質(zhì)研究。在此基礎(chǔ)上，本論文對該菌株所產(chǎn)的另一個木聚糖酶XynB進行了基因

4、序列、分子結(jié)構(gòu)、生化性質(zhì)及其N端結(jié)構(gòu)域的功能研究，并探討了木聚糖酶XynA在提高面包品質(zhì)中的應用潛力，取得了以下主要結(jié)果。
　　 1.木聚糖酶XynB的基因克隆和序列分析
　　 由于菌株G.mesophila KMM241與另一株基因組序列已經(jīng)公布的海洋細菌Pseudoalteromonas atlantica T6c的16S rDNA序列相似性為99％。根據(jù)菌株P(guān)seudoalteromonas atlantica T

5、6c基因組中木聚糖酶基因(Gene ID:4172855)的序列設(shè)計的一對特異性引物，以菌株G mesophila KMM 241基因組DNA為模板，PCR擴增得到了木聚糖酶基因xynB的全序列。序列分析表明，xynB基因序列全長2739 bp，編碼的木聚糖酶XynB的前體含912個氨基酸殘基。木聚糖酶XynB的前體由N端的信號肽序列(Metl-Ala43)，一個功能未知的N端結(jié)構(gòu)域(NTD，Glu44-Arg584)和一個C端的糖苷水

6、解酶第八家族(GH8)催化結(jié)構(gòu)域(CD，Ser585-Glu912)組成。通過序列比對發(fā)現(xiàn)只有三個酶與XynB氨基酸全序列具有同源性，分別是來自菌株P(guān).atlantica T6c(98％)、Glaciecola chathamensisS 18K6(80％)和Glaciecolapolaris LMG 21857(73％)的糖苷水解酶，但這三個酶都是從基因組序列中推定的糖苷水解酶，并沒有被研究報道。序列比對結(jié)果表明，XynB的催化結(jié)構(gòu)域

7、與其它酶的最高相似性只有41％，在已經(jīng)報道的第八家族木聚糖酶中，與之相似性最高的是來自環(huán)境DNA文庫的Xyn8（39％，ABB71891）。將XynB的催化結(jié)構(gòu)域與已報道的其它4個第八家族木聚糖酶氨基酸序列進行比對分析，發(fā)現(xiàn)了三個在第八家族木聚糖酶中高度保守的氨基酸殘基，分別為第586位的谷氨酸，第646位和第786位的天冬氨酸，這三個殘基被認為在第八家族糖苷水解酶的催化反應中起到重要作用。序列分析表明，XynB的NTD的氨基酸序列與數(shù)

8、據(jù)庫中已知功能的序列均沒有明顯的同源性，表明該NTD可能是一個結(jié)構(gòu)新穎的結(jié)構(gòu)域。因此，對XynB的序列分析表明，該酶是GH8家族中一個結(jié)構(gòu)新穎的多結(jié)構(gòu)域木聚糖酶。
　　 2.木聚糖酶XynB的異源表達和性質(zhì)研究
　　 XynB是一個多結(jié)構(gòu)域木聚糖酶，通過異源表達得到有活性的酶對酶的催化性質(zhì)研究非常重要。我們通過pET-22b原核表達系統(tǒng)，成功構(gòu)建了表達載體pET-22b-xynB，并且在大腸桿菌BL21(DE3)中實現(xiàn)了

9、可溶性表達。為了獲得較高的表達量和表達活性，我們進行了產(chǎn)酶條件優(yōu)化實驗，確定了最佳表達條件為在0.5 mM的IPTG誘導下15℃培養(yǎng)96 h，在此條件下重組大腸桿菌的胞內(nèi)酶活最高可達到4.2 U/ml菌液。由于電泳分析表明在最適條件下培養(yǎng)48 h，胞內(nèi)酶蛋白的表達量基本已達到最大，并且此時目的蛋白占細胞總蛋白的比例較高，我們選擇在最適條件下培養(yǎng)48 h后從胞內(nèi)分離純化重組木聚糖酶XynB，這不但利于重組酶的純化，而且縮短了培養(yǎng)時間。通過

10、細胞超聲破碎獲得胞內(nèi)可溶蛋白成分，再通過陰離子交換色譜層析和鎳柱親和層析兩步純化，得到了電泳純的重組XynB，SDS-PAGE顯示分子量約為100 kDa。根據(jù)氨基酸序列計算表明，XynB去掉信號肽之后的分子量為97.1 kDa。因此，重組表達的XynB是一個含有NTD和CD的多結(jié)構(gòu)域木聚糖酶。
　　 對重組XynB的底物特異性研究結(jié)果表明，該酶是一個特異性的內(nèi)切木聚糖酶，能高效水解山毛櫸木聚糖和燕麥木聚糖，對羧甲基纖維素、淀粉

11、、海藻多糖、幾丁質(zhì)以及甘露聚糖均沒有活性。XynB的最適酶活pH為6.0-7.0，在酸性條件下酶活喪失較快，在弱堿性條件下仍能保持較高的酶活，是一個中性略偏堿性的木聚糖酶。該酶在中性偏堿性較廣的pH范圍(pH6.0-pH10.0)內(nèi)比較穩(wěn)定，在15℃放1h后還能保持80％以上的殘余酶活。XynB的最適酶活溫度為35-40℃，在0℃和5℃時分別保持有最高酶活的7.5％和14.6％，該酶的熱穩(wěn)定性很差，在35℃保溫1h后只保持不到40％的殘

12、余酶活，在45℃保溫20 min便喪失全部酶活。這些結(jié)果說明該酶具有一定的適冷特征。 Co2+、SDS、EDTA、Zn2+、Ni2+、Mn2+和Li2+在5 mM濃度下能夠強烈抑制XynB酶活性，但在1 mM濃度下只有Co2+的抑制作用明顯。由于Fe3+和Cu2+兩種重金屬離子在1 mM濃度下對酶活幾乎沒有抑制作用，這可能使該酶在某些工業(yè)應用中具有優(yōu)勢。NaCl對XynB的活性并沒有促進作用，在低濃度NaCl存在時（0.5 M及以下），

13、XynB的酶活性受到輕微抑制作用（殘余酶活在85％以上）;當NaCl濃度從1.0M增加到接近飽和的4.0M時，該酶的殘余酶活僅從67％下降到約40％，表現(xiàn)出了較強的NaCl耐受性，這反映了該酶對海洋高鹽環(huán)境的適應。XynB對山毛櫸木聚糖和燕麥木聚糖的Km值分別為5.82 mg/ml和11.86 mg/ml，kcat/Km值分別為104.64ml/mg.s和60.03 ml/mg.s，表明XynB對山毛櫸木聚糖具有更高的親和力和催化效率。

14、XynB不能水解木三糖和木四糖，能夠高效水解木六糖生成木四糖、木三糖和木二糖，該酶水解木五糖的效率比水解木六糖時低很多，只能產(chǎn)生非常少量的木三糖和木二糖，另外所有的酶解反應中均沒有木糖產(chǎn)生，這表明XynB是一個嚴格的內(nèi)切木聚糖酶，需要至少5個糖基單元才能進行有效的水解。
　　 木聚糖酶在制漿造紙、食品、飼料、紡織等行業(yè)都有廣泛的應用，特別是制漿造紙工業(yè)是應用木聚糖酶最多的行業(yè)。XynB具有對熱敏感的特征，在一些不能進行高溫加熱的

15、食品加工領(lǐng)域中可能具有應用價值。另外，XynB具有耐鹽的特征，在海產(chǎn)品和其他含鹽產(chǎn)品的加工中也可能具有應用價值。
　　 3.NTD的異源表達以及NTD對不可溶多糖的結(jié)合功能研究
　　 為了研究NTD在XynB催化木聚糖降解中的作用，我們對NTD進行了單獨異源表達。通過pET-22b原核表達系統(tǒng)，成功構(gòu)建了NTD的表達質(zhì)粒，并且在大腸桿菌BL21(DE3)中實現(xiàn)了NTD的可溶性表達。為了獲得有活性的目的蛋白，對表達條件進行

16、了優(yōu)化，最終選擇的表達條件為:在15℃條件下用0.5 mM的IPTG誘導表達20 h。然后通過超聲波細胞破碎獲得胞內(nèi)可溶性蛋白，利用鎳柱親和層析法純化得到電泳純的重組NTD。為了驗證NTD在XynB催化木聚糖降解中是否具有結(jié)合底物的功能，我們首先利用SDS-PAGE檢測了NTD是否能結(jié)合不可溶木聚糖。實驗結(jié)果表明，NTD對不可溶木聚糖具有明顯的吸附結(jié)合能力。此外，NTD對也具有微晶纖維素很強的吸附結(jié)合能力，這些結(jié)果表明，NTD中可能含有

17、多糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBM)。由于NTD的氨基酸序列與已報道的CBM沒有同源性，所以NTD中含有的CBM可能是新型的CBM。
　　 4.NTD的蛋白結(jié)晶
　　 由于NTD的氨基酸序列與目前數(shù)據(jù)庫中已知功能的蛋白序列都沒有明顯的同源性，因此難以通過同源比對推測NTD中CBM的結(jié)構(gòu)。為了進一步揭示NTD的結(jié)構(gòu)與功能，我們決定通過結(jié)晶來解析NTD的結(jié)構(gòu)，然后分析其中可能含有的新型CBM的結(jié)構(gòu)。由于蛋白結(jié)晶需要大量高純度的蛋白，我們

18、首先對NTD進行了大批量高純度制備。經(jīng)過鎳柱親和層析，Q柱（強陰離子交換柱）層析和凝膠過濾層析3步純化，得到高純度的重組NTD蛋白樣品。將樣品濃縮到8 mg/ml濃度，經(jīng)過坐滴氣相擴散法初篩，確定出了有利于NTD晶體生長的條件，獲得一些雪花狀的小晶體。由于這些晶體太小，分辨率太低，我們又利用懸滴氣相擴散法進行了復篩，經(jīng)過結(jié)晶條件的優(yōu)化，得到了晶體生長的最佳條件為pH9.0的0.1M Tris-HCl緩沖體系，添加30％(w/v)的PEG

19、6000。在此條件下目前已長出棒狀晶體，該晶體經(jīng)SDS-PAGE分析已證實為蛋白結(jié)晶。這些晶體還在進一步生長之中，經(jīng)過進一步的生長之后，即可通過X射線衍射分析其分辨率。這些研究結(jié)果為進一步得到NTD晶體結(jié)構(gòu)進而闡明其多糖結(jié)合作用機制以及NTD與CD的協(xié)同作用機制奠定了基礎(chǔ)。
　　 5.木聚糖酶XynA提高面包品質(zhì)的應用潛力研究
　　 我們的前期研究表明，Glaciecola mesophila KMM 241分泌的木聚糖

20、酶XynA是一個GH10家族的適冷木聚糖酶。本論文研究了木聚糖酶XynA提高面包品質(zhì)的潛力，并與GH10家族的中溫木聚糖酶EX1進行了比較。最適添加量的分析表明，EX1的最適添加量為270 U/kg，而Xyn A的最適添加量為0.9 U/kg。添加Xyn A和EX1都會使面粉的弱化度降低，在最適添加量下可使弱化度降低50％，但是在降低面團形成時間方面，Xyn A的作用較EX1更顯著。在面包體積的影響來看，兩種木聚糖酶的作用都很顯著。這兩