中國(guó)牦牛瘤胃微生物來源的雙功能木聚糖酶-內(nèi)切葡聚糖酶的克隆及功能研究.pdf

1、木質(zhì)纖維素是自然界中儲(chǔ)量最豐富的可再生資源,是21世紀(jì)解決環(huán)境污染、食品短缺、能源危機(jī)的有效途徑,而生物能源的技術(shù)瓶頸則是纖維素酶。為尋找新型、高效的木質(zhì)纖維素酶,本研究利用宏基因組技術(shù),對(duì)中國(guó)牦牛瘤胃微生物纖維素降解酶基因資源進(jìn)行了研究。在本研究中,通過對(duì)中國(guó)牦牛瘤胃宏基因組cosmid文庫(kù)的活性篩選,獲得能夠水解羧甲基纖維素鈉(CMC)的陽性克隆,進(jìn)一步通過構(gòu)建亞克隆、測(cè)序、同源比對(duì)的方法獲得內(nèi)切葡聚糖酶基因RuCelA的cds序列

2、,該基因編碼區(qū)長(zhǎng)1656bp,編碼了551個(gè)氨基酸,分子量約60kD,隸屬于纖維素水解酶家族5。利用大腸桿菌表達(dá)獲得重組蛋白R(shí)uCelA,并對(duì)其進(jìn)行了酶學(xué)屬性的研究。以CMC為底物時(shí),其內(nèi)切葡聚糖酶活性在50℃、pH=5.0時(shí)酶的活性最高;而以木聚糖為底物時(shí),其木聚糖酶活性在65℃、pH=7.0時(shí)活性達(dá)到最大。Co+、Co2+可以明顯提高RuCelA內(nèi)切葡聚糖酶活性,卻抑制木聚糖酶活性。通過對(duì)大麥葡聚糖、木聚糖等底物的非完全水解產(chǎn)物按時(shí)

3、取樣進(jìn)行TLC分析,證實(shí)了RuCelA內(nèi)切葡聚糖酶及木聚糖酶的水解模式均為內(nèi)切模式,通過對(duì)完全水解產(chǎn)物的TLC及HPAEC分析發(fā)現(xiàn)二糖、三糖、四糖為主要水解產(chǎn)物,伴隨有少量單糖。RuCelA可以水解糖類的最小聚合度為三糖。在底物特異性研究中發(fā)現(xiàn),RuCelA對(duì)濾紙有一定的水解活性,RuCelA對(duì)含有β-1,3/4糖苷鍵的大麥葡聚糖及地衣多糖底物有非常高的降解能力,對(duì)含有β-1,4糖苷鍵的底物如木聚糖、羥乙基纖維素、CMC等底物具有一定的

4、降解能力,而對(duì)不含β-1,4糖苷鍵的底物,如只含β3-1,3糖苷鍵的葡聚糖及含β-1,3/6糖苷鍵的海藻多糖,并無降解能力。RuCelA可以與葡萄糖苷酶及木糖苷酶在對(duì)大麥葡聚糖及木聚糖的水解過程中表現(xiàn)出明顯的協(xié)同作用。此外,利用雙功能RuCelA可以在45℃實(shí)現(xiàn)對(duì)堿預(yù)處理的木質(zhì)纖維素長(zhǎng)達(dá)14天的單酶降解,得到的還原糖濃度要高于同酶活水平下的單功能酶,并與單功能酶混合使用時(shí)得到的還原糖濃度基本持平。這說明,雙功能酶RuCelA可以作為兩種