耐堿性木聚糖酶高產(chǎn)菌株的篩選、產(chǎn)酶條件優(yōu)化及其木聚糖酶基因的克隆.pdf

1、耐堿性木聚糖酶高產(chǎn)菌株的篩選、產(chǎn)酶條件優(yōu)化及其木聚糖酶基因的克隆摘要本實驗是采用剛果紅染色的方法篩選出一株耐堿性木聚糖酶高產(chǎn)菌株，對其性質(zhì)進行研究，并得到編碼木聚糖酶的基因，實現(xiàn)該基因在大腸桿菌中的高表達，以滿足生產(chǎn)中的需要。(1)根據(jù)木聚糖酶分解木聚糖底物生成的寡糖不能被剛果紅染色，從而在菌落周圍形成透明圈這一特性，對采集的樣品進行生抱子處理，并在篩選培養(yǎng)基上進行初篩和復(fù)篩，最終得到一株木聚糖酶高產(chǎn)菌株，命名為BYGS一加N，對該菌株

2、進行普通染色、革蘭氏染色和16srDNA的鑒定，最終確定該菌株為短小芽抱桿菌(Bacilluspumilus)。(2)產(chǎn)酶菌株生長曲線和木聚糖酶酶學性質(zhì)的研究:BYGS一20N菌株接種到LB培養(yǎng)基，6h開始進入對數(shù)生長期，24h時達到生長高峰，在36h時細菌的生長將到最低，隨后出現(xiàn)了二次生長，細菌生長的最適pH值為7.0一8.0。為了給菌體提供有效的營養(yǎng)，對培養(yǎng)基中的氮源和碳源進行了優(yōu)化，在培養(yǎng)基中添加無機氮(NI么N03)的基礎(chǔ)上，用

3、腸(3礴)拉丁方設(shè)計對有機氮牛肉膏、蛋白陳、酵母提取物進行比較，最終確定產(chǎn)酶的最佳組合為牛肉膏1.0%、蛋白陳0.5%、酵母提取物0.5%。在即定氮源的基礎(chǔ)上，對碳源進行優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)木聚糖的產(chǎn)酶效果最好，木糖其次，而葡萄搪和麥芽糖有明顯的抑制作用，說明BYGS一20N所分泌的木聚糖酶為誘導型酶，并且受木聚糖和木糖的雙重誘導。通過氮源和碳源的選擇，木聚糖酶的活力高達巧olU方111，并未優(yōu)化前提高了52.54%。對BYGS一20N分泌木

4、聚糖酶的酶學性質(zhì)進行了研究，改變木聚糖酶作用時的溫度和pH值，確定該酶的最適值及其耐受性。結(jié)果顯示:該酶最適反應(yīng)溫度為酶反應(yīng)的最適溫度為50℃。在60℃時酶活仍有5.36%，證明該酶屬于嗜中溫酶類，不具有高溫耐受性二酶反應(yīng)最適pH值為7.0，在pH為8.0時剩余木聚糖酶的活力為91.1%，即使反應(yīng)pH值升高到9.0和10.。時，剩余酶活力仍在75%以上，說明該菌株具有耐堿性。通過對木聚糖酶的簡單動力學分析，得出反應(yīng)分解速率的兩個重要參數(shù)

5、Km=42297mg加1vmax二住0123m留m卜min對BYGS一20N的發(fā)酵液進行濃縮，并對蛋白進行定量得到該木聚糖酶的比活性為615lu加ga(3)編碼基因的獲得及蛋白表達:利用通用引物，從所篩選的菌株BYGS一20N基SCEENEOFHIGH一PRODUCI’NGBACTERIUMOFALKALI一RESISIANTXYLANASE，OPTIMIZEOFXYLANASEPRODUCINGCL《)NEOFXYLANASEGENE

6、SABTRACTTheaimofthisexPerimentistosceenahigh一xylanaseProducingbacterium，reaserchthePr(JPertiesofit，gett】1egenescodingthexylanaseandachievehighexPressionofthexyl助aseinE.coli，thensatisfytheneedofPTactice.(1)Itisbasedontheo

7、ligosesProducedbythexylanasesbreakingdownxylansubstratescan，tbedyebyKongored，soatransparentcirclewillbeformedamongthebacterium，thegatheredsamPles，atfirst，aredealedwiththeProcessingofsPoredisPosingProcess，thenthroughthefi

8、rstsceeningaI1dthesecondsceeningonthefiltrateculturemedium，atlastacquireahigh一xylanaseProducingbacterium，namingBYGS一20NJtwonfirmedBYGS一20NisBacillusPumilusontheconunondye，Gramstainingandl6SrDNAidentifr.(2)Researchonthegr

9、o、Vt11curveofthebaciIIusandtheProPertiesofxylanse:BYGS一20NwasinoculatedintheLBculturemedium，itaPPearthelogarithn1growthPeriodat6hafterinoculation，andhavethefastigiumat24h.thegr0wt11decreaseintotheneapat36h，Iaterithavease

10、condgrowth.theoPtimumPHis7乃一8.0，InordertosuPPIytl1eemencynutritionforthebacteriuxn，thenitrogensourceandcarbonsourceintheculturemediumwereoPtimized0nthebasisoftheaddingoftheinorganic爪trogen(N玩NO3)，Lg(3‘)Iatindesignwasus比t

11、ocompare比eo嗯anic苗trogenamongbef『ease、PePtoneandyeast，itisascertainedtheoPtiumcomPoundingisbeefgrease10%，PePtoneo.5%，yeast05%.Theresu1tisxy1anisthebestinductionforxy1anaseProducing，xyloseisnext，butglucoseandmaltosedepress

12、thexylandePosing.ItisexlainedthatthexylanseofByGS一20Nbelongtoinduceenzyme.anditwasdoub]e一inducedbyxylanandxylose.1七eactivityofthexylanasewashighlyobtainedasl50IUml，itisenhanced5254%thanse1ectionsofnitrogenandcarbonsource

13、before.TheresearchwasalsoPe而rmedontheProPertiesofxylanase，toadfirmthetemPretureandPHoPtimumandresistantofxylanaseBothinthetimeofxylanaseworkingarechangedtheresultisthattheoPtimumtemPretureofxylanseis50℃，italsohave55.36%e