小麥木聚糖酶抑制蛋白的性質及對外源木聚糖酶功效的影響研究.pdf

1、β-1，4-內切木聚糖酶可解除大麥、小麥和麥麩等谷物原料中木聚糖的不利影響。然而，由于小麥中木聚糖酶抑制蛋白的含量較高，對小麥加工中外加木聚糖酶的活力產(chǎn)生了較強的抑制作用，從而導致木聚糖酶并不能完全發(fā)揮其應有的作用。本課題研究了小麥中抑制蛋白對抗性酶和敏感酶的不同作用，詳細結果如下:
　　(1)小麥籽粒中抑制蛋白的純化及抑制性質。在不同谷物中，小麥、黑麥、蕎麥和綠麥中具有較高的木聚糖酶抑制活性，在燕麥與大麥中較低，水稻、玉米和高粱

2、中沒有檢測到木聚糖酶抑制活性。從小麥品種小偃22中分離純化到一種木聚糖酶抑制蛋白，該蛋白的分子量為29kDa，與其他木聚糖酶抑制蛋白N端序列無同源性，但與大麥幾丁質酶的N端序列高度同源，卻無幾丁質酶活性;該抑制蛋白對黑曲霉GH11木聚糖酶抑制作用較強，但對真菌GH10木聚糖酶沒有抑制作用，綜合上述性質推測該抑制蛋白可能是一新型的XIP型木聚糖酶抑制蛋白。純化的抑制蛋白對GH11家族木聚糖酶抑制作用的最適溫度為30℃，最佳抑制時間為40m

3、in;該抑制蛋白的半失活溫度為74℃，熱穩(wěn)定性較好。
　　(2)小麥抑制蛋白基因的克隆、表達及抑制性質。利用RT-PCR的方法從鄭麥9023和鄭麥366兩個小麥品種幼胚中分別克隆了xip-9023和xip-366兩個XIP型抑制蛋白的基因，結果顯示XIP-9023與模板蛋白XIP-Ⅰ氨基酸序列完全一致，XIP-366與模板蛋白有1個氨基酸差異，表明不同小麥品種中XIP基因具有微小的差異。XIP-9023蛋白對木聚糖酶的最適抑制pH

4、和最適抑制溫度分別為pH7和40℃。XIP-9023蛋白與木聚糖酶在反應40min時抑制作用達到峰值。當木聚糖酶活力被抑制50％時，抑制蛋白與酶的摩爾比為26∶1。本實驗采用的真菌木聚糖酶均可被XIP-9023抑制，同時首次發(fā)現(xiàn)來自牛瘤胃的一株細菌Paenibacillus spp.所產(chǎn)木聚糖酶也能被XIP-9023強烈抑制。
　　(3)抗性木聚糖酶突變體構建及篩選。通過分析XIP與構巢曲霉GH10木聚糖酶相互作用的晶體結構，設計

5、了黑曲霉GH10木聚糖酶的30個單點突變體;根據(jù)細菌及植物GH10木聚糖酶中與底物結合比較重要的短肽結構，將其序列整體置換到黑曲霉GH10木聚糖酶的相應位置中，最終獲得了22個突變體;但多數(shù)木聚糖酶突變體活力大幅度降低，甚至完全喪失。由于XIP抑制蛋白屬于競爭性抑制劑，能夠與底物競爭性的結合木聚糖酶中相同的位點，因此通過底物結合位點突變獲得抑制蛋白抗性木聚糖酶，使其能夠與底物結合，但對抑制蛋白失去結合能力，可能并不是一條可行的突變策略。

6、
　　(4)抑制蛋白的抗性木聚糖酶的篩選及性質。對實驗室保存木聚糖酶產(chǎn)生菌以及商品化的木聚糖酶進行了研究，結果發(fā)現(xiàn)多數(shù)真菌的木聚糖酶粗酶液均能被XIP-9023所抑制，抑制率從24％到70％不等，這與已知的研究結果相一致。本實驗首次研究并發(fā)現(xiàn)鏈霉菌的木聚糖酶受到XIP-9023的嚴重抑制，并發(fā)現(xiàn)新麗鞭毛菌的木聚糖酶對XIP-9023抑制蛋白具有明顯的抗性，抑制率為6％。等摩爾比例下反應時發(fā)現(xiàn)新麗鞭毛菌的木聚糖酶純酶對XIP-902

7、3具有強烈的抗性。抗性酶的質譜分析結果與UniProt數(shù)據(jù)庫中Q9UV68、Q01426、Q69IG9木聚糖酶序列匹配，其中以Q69IG9木聚糖酶基因為模板合成的木聚糖酶XYN3具有酶活力，不同摩爾比例下進行反應時，XIP-9023抑制蛋白對該重組抗性木聚糖酶XYN3沒有抑制作用，因此確定木聚糖酶XYN3為抗性木聚糖酶。該抗性酶最適反應條件分別為pH5.4和60℃;抗性木聚糖酶XYN3在pH3.6時具有最大酶活力的72％，40℃下保溫3

8、0min后抗性酶依然殘留80％以上的酶活力，因此該酶具有較好的酸適應性和熱穩(wěn)定性。將重組抗性木聚糖酶XYN3與A.niger的敏感木聚糖酶（UniProt登錄號P55328）和Penicillium funiculosum敏感木聚糖酶(UniProt登錄號Q9HFH0)進行序列比對，發(fā)現(xiàn)抗性木聚糖酶的“拇指”部位氨基酸發(fā)生了GTS到GGSE的突變。
　　(5)抗性木聚糖酶XYN3對不同比例小麥玉米混合料的酶解作用。在小麥比例為20

9、％～60％時，抗性酶XYN3在42℃或39℃下的還原糖產(chǎn)量始終高于敏感酶的還原糖產(chǎn)量，表明抗性酶比敏感酶降解小麥木聚糖更為有效。小麥比例為20％時添加抗性酶產(chǎn)生總糖為3.239g/L，相比敏感酶提高了8.36％，尤其是木二糖含量增加了45％。小麥比例為40％時，抗性酶比敏感酶的降解產(chǎn)物木寡糖和木糖總量增加了6.5％，其中木二糖含量增加了89％。酶解反應系統(tǒng)中添加豬消化液時，抗性酶在39℃下催化小麥產(chǎn)生的還原糖量最大值比敏感酶提高23％。