EPO對橫紋肌溶解致急性腎損傷的保護(hù)作用機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的：
　　急性腎損傷（AcuteKidneyInjury，AKI）作為一種臨床常見急、危重癥。而橫紋肌溶解(Rhabdomyolysis，RM)性急性腎損傷是AKI的一種，占所有AKI患者的10％～15％[1-4]。到目前為止，主要以擴(kuò)容、利尿、糾正電解質(zhì)紊亂及血液凈化等對癥治療，但療效不佳，AKI患者的發(fā)病率及死亡率仍居高位。所以預(yù)防、減少橫紋肌溶解后AKI的發(fā)生有重要的意義。促紅細(xì)胞生成素(Erythropoietin

2、，EPO)是一種分子量為30.4kD的糖蛋白，主要由腎臟皮質(zhì)、髓質(zhì)交界處的腎小管旁細(xì)胞分泌。EPO可以通過抑制氧化應(yīng)激、抑制炎癥反應(yīng)、抗細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腎小管細(xì)胞的再生等對急性腎損傷起保護(hù)作用。EPO對腎臟具有保護(hù)作用的研究多集中在腎毒性及缺血再灌注性AKI中。EPO對橫紋肌溶解性AKI動物模型是否通過抗炎和抗凋亡共同作用從而減輕腎小管上皮細(xì)胞損傷、凋亡,促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞恢復(fù),目前文獻(xiàn)報(bào)道較少。本研究擬通過建立成年大鼠RMAKI模型，檢

3、測予EPO干預(yù)后不同時(shí)間點(diǎn)MCP-1和Bcl-2變化情況，評價(jià)MCP-1和Bcl-2在EPO干預(yù)后腎臟的表達(dá)情況，探討EPO對AKI的作用機(jī)制。以期找到EPO在治療橫紋肌溶解導(dǎo)致急性腎損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，為大批出現(xiàn)橫紋肌溶解患者預(yù)防急性腎損傷提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　以SPF級雄性SD大鼠為實(shí)驗(yàn)對象，予肌肉內(nèi)注射50％甘油(10ml/Kg)，建立急性腎損傷模型。將36只SD大鼠按數(shù)字隨機(jī)表法分為3組，正常對照組（CN組）、

4、急性腎損傷組（AKI組）、促紅細(xì)胞生成素干預(yù)組（EPO組），每組12只。各組又按時(shí)間點(diǎn)分為24h組和48h組兩個(gè)亞組，每組6只。分別于24h、48h腹腔注射10%水合氯醛（0.3ml/kg）麻醉，腹正中線切開，下腔靜脈采血后處死，留取左腎組織做石蠟切片。全血離心后留取血清，保存于-20℃冰箱，留測血清肌酐、尿素氮、磷酸肌酸激酶及肌紅蛋白。左腎組織置于10%中性福爾馬林溶液中固定，石蠟包埋以做常規(guī)HE染色觀察腎組織病理變化，免疫組織化學(xué)染

5、色觀察MCP-1和Bcl-2的表達(dá)及分布。
　　結(jié)果：
　　1、CN組大鼠精神狀態(tài)好,反應(yīng)敏銳,自由活動。肌注50%甘油生理鹽水后,AKI組大鼠注射部位出現(xiàn)局部水腫,活動困難,無法站立,體毛無光澤,拒進(jìn)食水,精神差,對聲光等刺激反應(yīng)遲鈍,約2h出現(xiàn)紅棕色、深褐色尿，24h尿量明顯較少,甚至無尿,48h后上述癥狀均好轉(zhuǎn)。與同時(shí)間點(diǎn)的AKI組相比較,EPO組大鼠一般情況及精神狀態(tài)較好。
　　2、甘油生理鹽水誘導(dǎo)發(fā)生急性腎損

6、傷后,AKI組及EPO組的Mb、BUN、Scr、及CK均顯著高于CN組(P<0.05)。與同時(shí)間點(diǎn)的AKI組相比較,EPO組Mb、BUN、Scr和CK明顯降低(P<0.05)。
　　3、光鏡：CN組腎組織無明顯改變。AKI組及EPO組發(fā)生急性腎損傷，有缺血缺氧表現(xiàn)腎小球囊擴(kuò)張、毛細(xì)血管袢被擠壓至血管極測，近端腎小管上皮細(xì)胞水腫，呈空泡樣變性，腎間質(zhì)水腫、間質(zhì)內(nèi)有大量炎癥細(xì)胞浸潤及腎小管上皮細(xì)胞刷狀緣脫落、細(xì)胞核深染、固縮，于皮髓質(zhì)

7、交界處及髓質(zhì)區(qū)顯著，部分腎小管腔內(nèi)可見蛋白管型及顆粒管型等，腎小管損傷積分升高。與AKI組比較，EPO組腎小球及腎小管損傷程度均減輕，腎小管損傷評分降低。
　　4、腎組織Bcl-2免疫組化染色結(jié)果示：Bcl-2陽性表達(dá)為棕黃色，主要表達(dá)在腎小管細(xì)胞漿中。肌注甘油的2組大鼠24h腎組織中均存在明顯的小管細(xì)胞凋亡，EPO干預(yù)組凋亡情況減輕；所有肌注甘油的大鼠腎組織抗凋亡因子Bcl-2的蛋白質(zhì)表達(dá)均比正常對照組增加，EPO干預(yù)組增加更加

8、明顯。
　　5、腎組織MCP-1免疫組化染色結(jié)果示：CN組腎小管MCP-1蛋白為陰性表達(dá)，AKI組腎小管MCP-1蛋白為陽性表達(dá)，近曲小管及少數(shù)遠(yuǎn)曲小管細(xì)胞胞漿內(nèi)可見彌散分布的棕色顆粒，腎小球呈弱陽性或者陰性表達(dá)。AKI組MCP-1免疫組化染色陽性面積百分比明顯高于CN組。與AKI組比較，EPO干預(yù)組MCP-1免疫組化染色陽性面積百分比明顯降低。
　　6、腎小管TUNEL法檢測結(jié)果示：甘油注射后各實(shí)驗(yàn)組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量

9、顯著上升，各時(shí)相點(diǎn)與對照組比較，差異顯著(P<0.05)，均在24h達(dá)到峰值，隨后逐漸下降。與AKI組相比較，EPO組的TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)顯著下降(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、甘油生理鹽水法成功制作了橫紋肌溶解致急性腎損傷動物模型；
　　2、EPO可以改善腎功能，減輕腎臟病理損傷，對橫紋肌溶解所致急性腎損傷起保護(hù)作用；
　　3、EPO對大鼠的保護(hù)作用，可能是通過上調(diào)抗凋亡因子Bcl-2蛋白表達(dá)和下調(diào)M