橫紋肌溶解致急性腎損傷腎小管細(xì)胞的凋亡機(jī)制.pdf

1、目的：探討肌紅蛋白是否能引起小管細(xì)胞凋亡及其凋亡途徑。
　　 方法：(1)以不同濃度的維生素C還原100umol/L肌紅蛋白，Mb與VitC的比例分別為1∶0.63;1:1.25;1:2.5;1∶5；1∶10;1∶15，利用分光光度計測量VitC還原肌紅蛋白的最佳濃度。(2)設(shè)定單純Mb組、Mb+VitC組、VitC組(Mb200umol/L，Vit C2mmol/L)、Con組，刺激HK2細(xì)胞時間為分別0h，24h，48h，9

2、6h，通過MTT法來檢測增殖情況，使用自動生化分析儀測量LDH值。(3)按照不同濃度還原態(tài)肌紅蛋白分組，分組如下：Mb200uM+VitC2mM組、Mb100uM+VitC1mM組、Mb50uM+VitC500uM組、Mb25uM+VitC250uM組、Mb12.5uM+VitC125uM組、Con組，刺激HK2細(xì)胞時間分別為0h、24h、48h、96小時，通過MTT法來檢測HK2細(xì)胞增殖情況，使用自動生化分析儀測量LDH值。(4)流式

3、細(xì)胞儀檢測正常培養(yǎng)基(Con)組及Mb200uM+VitC2mM組，刺激HK2細(xì)胞48h后細(xì)胞凋亡情況。(5)以Mb200uM+VitC2mM為刺激物，根據(jù)刺激時間分為7組，分別為0h(Con)組、3h組、6h組、12h組、24h組、36h組、48h組，檢測蛋白質(zhì)水平GRP78、CytC、Caspase9、Caspase8、Caspase4/5。
　　 結(jié)果：(1)當(dāng)Mb與VitC濃度比為1∶10時，在分光光度計檢測還原態(tài)繼紅蛋

4、白的620nm處達(dá)高峰。(2)Mb+VitC組細(xì)胞增殖能力較Con組明顯降低，Mb+VitC組LDH較Con組升高。(3)Mb200uM+VitC2mM組細(xì)胞增殖能力較Con組明顯降低，Mb200uM+VitC2mM組LDH較Con組升高。(4)流式細(xì)胞儀檢測Mb200uM+VitC2mM組凋亡早期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)較正常培養(yǎng)基(Con)組顯著增高。(5)GRP78蛋白水平表達(dá)在3h、6h、12h、24h組較Con組顯著增加，CytC蛋白水平表

5、達(dá)在12h、24h、36h、48h組較Con組顯著增加，Caspase9蛋白水平表達(dá)在6h、12h、48h組較Con組顯著增加，Caspase8、4/5蛋白水平表達(dá)無明顯變化。
　　 結(jié)論：(1)維生素C可以還原肌紅蛋白且維生素C與肌紅蛋白的濃度比例為10:1時，可將肌紅蛋白充分還原。(2)在細(xì)胞內(nèi)起損傷作用的肌紅蛋白為還原態(tài)。(3)200umol/L還原態(tài)肌紅蛋白刺激48h可以引起HK2細(xì)胞凋亡。(4)肌紅蛋白刺激通過線粒體途