TNF-α對SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化的影響及相關(guān)分子機制的探討.pdf

1、目的：通過探討炎癥因子 TNF-α對 SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）成脂分化的影響及相關(guān)的分子機制，為臨床治療和預(yù)防肥胖相關(guān)代謝性疾病提供理論基礎(chǔ)。
　　方法：（1）采用全骨髓細(xì)胞貼壁法分離、純化和培養(yǎng) SD大鼠BMSCs。（2）使用生長良好的第3代（P3）SD大鼠BMSCs進行成脂、成骨分化誘導(dǎo)，鑒定BMSCs多向分化的能力；流式細(xì)胞術(shù)檢測BMSCs表

2、面標(biāo)志物 CD90、CD44、CD45、CD29、CD11b的表達。（3）MTT法檢測不同濃度TNF-α（1、10、20、50、100ng/ml）在不同培養(yǎng)時間（24h、48h、72h）對BMSCs增殖的影響；油紅O染色及異丙醇萃取后檢測 OD值觀察不同濃度 TNF-α（1、10、20、50、100ng/ml）對SD大鼠BMSCs成脂分化的影響。（4）將SD大鼠BMSCs分為對照組(Con組)、成脂誘導(dǎo)組(Ad組）和10ng/mL TN

3、F-α干預(yù)成脂誘導(dǎo)組(Ad+TNFα組)，分別于培養(yǎng)的第3、7、14天收集各組的細(xì)胞RNA， RT-PCR檢測各組基因 wnt10b、前體脂肪細(xì)胞因子-1（ Preadipocytes factor-1, Pref-1）、CCAAT區(qū)增強子結(jié)合蛋白-α（CCAAT/enhancer-binding protein-α，C/EBP-α)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated re

4、ceptor-γ，PPAR-γ）、脂肪酸結(jié)合蛋白-4（fatty acid binding protein-4，F(xiàn)ABP-4）的mRNA在不同培養(yǎng)時間下的表達水平。（5）于第14天收集3組細(xì)胞總蛋白， Western blot檢測細(xì)胞中β-catenin、PPAR-γ、C/EBP-α、FABP-4的蛋白表達水平。
　　結(jié)果：（1）全骨髓貼壁法分離、純化和培養(yǎng)的細(xì)胞為長梭形，核大，核仁2-3個，清晰可見，呈典型的漩渦狀生長；具有成骨

5、、成脂分化潛能，流式細(xì)胞術(shù)鑒定發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞陽性表達CD29、CD90、CD44，陰性表達CD45、CD11b。（2）MTT結(jié)果顯示，TNF-α對SD大鼠BMSCs增殖的抑制作用呈時間-劑量依賴關(guān)系。從培養(yǎng)的第48h開始，相同時間下，細(xì)胞增殖率與TNF-α濃度呈負(fù)相關(guān)；相同濃度下，細(xì)胞增殖率與培養(yǎng)時間呈反比。隨著培養(yǎng)時間的延長，較高濃度（20-100ng/ml）的TNF-α對BMSCs增殖率抑制的影響無明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。（3

6、）油紅O染色和OD值結(jié)果顯示，TNF-α可以抑制BMSCs的脂肪分化，該抑制作用與濃度呈正相關(guān)。（4）RT-PCR結(jié)果顯示，在Ad+TNFα組，隨著時間的延長，wnt10b、Pref-1的mRNA水平明顯增加并高于Con組和Ad組（P<0.05），而C/EBP-α、PPAR-γ、FABP-4的mRNA水平則顯著低于Ad組。Western blot結(jié)果顯示，誘導(dǎo)14天后，Ad+TNFα組C/EBP-α、PPAR-γ、FABP-4的蛋白水平

7、明顯低于Ad組（P<0.05）。磷酸化的β-catenin（P-β-catenin）蛋白水平也顯著低于Ad組(P<0.05)。
　　結(jié)論：（1）多向分化功能鑒定和流式細(xì)胞鑒定結(jié)果可知，實驗中分離、純化和培養(yǎng)的細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。（2）TNF-α對 SD大鼠BMSCs增殖的抑制作用呈時間-濃度依賴關(guān)系；TNF-α可以抑制SD大鼠 BMSCs的脂肪分化，該抑制作用與其濃度呈正相關(guān)。（3）TNF-α通過激活 wnt/β-cateni