盤(pán)基網(wǎng)柄菌發(fā)育期間蛞蝓體的形態(tài)學(xué)以及類(lèi)免疫細(xì)胞的研究.pdf

1、盤(pán)基網(wǎng)柄菌(Dictyostelium discoideum)隸屬原生動(dòng)物,是一類(lèi)社會(huì)阿米巴蟲(chóng),當(dāng)生長(zhǎng)條件良好時(shí),細(xì)胞會(huì)以二分裂方式來(lái)繁殖后代;當(dāng)生存環(huán)境惡劣時(shí),進(jìn)行多細(xì)胞發(fā)育,整個(gè)發(fā)育過(guò)程約需24 h,大致分4個(gè)階段:細(xì)胞聚集(aggregation)階段、細(xì)胞丘(mound)階段、蛞蝓體(slug)階段和子實(shí)體(fruiting body)階段。蛞蝓體可細(xì)分為“突起”時(shí)期、“蛞蝓”時(shí)期和“拔頂”時(shí)期。蛞蝓體階段的細(xì)胞分為前柄細(xì)胞和前

2、孢子細(xì)胞兩大類(lèi),前柄細(xì)胞又可分PstA細(xì)胞、PstB細(xì)胞、PstO細(xì)胞和PstAB細(xì)胞;前孢子細(xì)胞只有Psp細(xì)胞。到子實(shí)體階段前柄細(xì)胞發(fā)育成柄細(xì)胞,前孢子細(xì)胞發(fā)育成孢子細(xì)胞,一旦條件合適,孢子細(xì)胞萌發(fā)開(kāi)始新生命周期,而柄細(xì)胞無(wú)論在什么條件下都不能萌發(fā),因此柄細(xì)胞是凋亡細(xì)胞?？梢?jiàn),盤(pán)基網(wǎng)柄菌細(xì)胞發(fā)育和高等生物發(fā)育相似,同樣存在著細(xì)胞分化和細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。蛞蝓體時(shí)期是細(xì)胞分化和細(xì)胞開(kāi)始衰退的起始階段。由于受到環(huán)境影響及其個(gè)體大小存在差異,蛞蝓

3、體的個(gè)體發(fā)育的并不是完全同步的,但整個(gè)蛞蝓體階段只有兩個(gè)小時(shí),故以往都把蛞蝓體看成一個(gè)時(shí)期,蛞蝓體具體的形態(tài)發(fā)育過(guò)程卻未見(jiàn)報(bào)道。由于各類(lèi)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)速度不同,蛞蝓體形態(tài)發(fā)生了巨大的變化。本工作用吖啶橙(Acridine orange,AO)和Hoechst33342(HO)兩種活體熒光染料,在盤(pán)基網(wǎng)柄菌細(xì)胞發(fā)育活體狀念下,通過(guò)熒光顯微鏡觀察盤(pán)基網(wǎng)柄菌細(xì)胞的分化情況,以期了解盤(pán)基網(wǎng)柄菌細(xì)胞發(fā)育,特別是蛞蝓體發(fā)育的具體過(guò)程及發(fā)育過(guò)程中出現(xiàn)的細(xì)胞

4、分化及凋亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn):占整個(gè)蛞蝓體近4/5細(xì)胞的細(xì)胞核在整個(gè)發(fā)育過(guò)程中始終都染成藍(lán)色,細(xì)胞未見(jiàn)衰退跡象,因此最終發(fā)育成孢子細(xì)胞。這與孢子細(xì)胞能夠萌發(fā),形成新的生命體是相符合的。而位于蛞蝓體前部,占整個(gè)蛞蝓體1/5細(xì)胞的細(xì)胞核隨著發(fā)育進(jìn)程,細(xì)胞核先被染成藍(lán)綠色,然后被染成綠色,再成橙色,直到最后顯不出顏色。發(fā)育至蛞蝓體后期時(shí),在蛞蝓體內(nèi)部可看到一“通道”,“通道”內(nèi)部被染成綠色,在發(fā)育成子實(shí)體時(shí)候,在“通道”內(nèi)部可見(jiàn)淺藍(lán)綠色的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)

5、,并且蛞蝓體時(shí)期的“通道”位置與子實(shí)體時(shí)期的柄的位置一致,由此推測(cè),子實(shí)體的柄極有可能是“通道”發(fā)育而來(lái)的。這些數(shù)據(jù)提示從蛞蝓體前期開(kāi)始,前柄細(xì)胞就已經(jīng)開(kāi)始凋亡,但細(xì)胞并不是馬上死亡,而是一個(gè)漸進(jìn)的凋亡過(guò)程,細(xì)胞核的功能一開(kāi)始并不是完全消失,而是隨著細(xì)胞凋亡進(jìn)程,逐漸喪失其功能,前柄細(xì)胞徹底凋亡后其細(xì)胞核才徹底喪失。因此按照染色的結(jié)果來(lái)看,蛞蝓體前柄細(xì)胞發(fā)育至少可分成4個(gè)時(shí)期,藍(lán)綠色期、綠色期、橙色期和無(wú)色期。因此可以通過(guò)細(xì)胞核著色不同

6、,來(lái)了解具體形態(tài)發(fā)育過(guò)程及其細(xì)胞的衰退程度,這為以后研究盤(pán)基網(wǎng)柄菌的發(fā)育提供依據(jù)。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,筆者發(fā)現(xiàn)當(dāng)Hoechst33342的濃度高于10μg/mL時(shí),不再僅僅染活細(xì)胞的細(xì)胞核,會(huì)引起細(xì)胞死亡或引起細(xì)胞發(fā)生某些應(yīng)急反應(yīng),即對(duì)盤(pán)基網(wǎng)柄菌產(chǎn)生毒性效應(yīng)。在蛞蝓體階段會(huì)出現(xiàn)一類(lèi)吞噬Hoechst33342有毒物質(zhì)的細(xì)胞。這類(lèi)有特殊的功能細(xì)胞與高等生物的的免疫細(xì)胞功能相似,也有解毒和免疫樣活性,筆者稱(chēng)之為類(lèi)免疫細(xì)胞。為了進(jìn)一步驗(yàn)證類(lèi)免疫細(xì)胞

7、的存在,實(shí)驗(yàn)中用熒光染料EB作為盤(pán)基網(wǎng)柄菌生長(zhǎng)環(huán)境中所遇毒物的替代品,通過(guò)熒光顯微鏡觀察,激光共聚焦顯微鏡觀察定位以及流式細(xì)胞儀來(lái)確定類(lèi)免疫細(xì)胞的所處細(xì)胞群及其所占細(xì)胞比例。已知EB除了有毒外還可以穿過(guò)受損細(xì)胞膜對(duì)細(xì)胞核著色,我們先通過(guò)熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察定位實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn),EB并不是定位在細(xì)胞核中,因而說(shuō)明其不是與DNA結(jié)合而顯色的,而是被包裹在細(xì)胞內(nèi)。通過(guò)熒光顯微鏡觀察研究發(fā)現(xiàn)類(lèi)免疫細(xì)胞不但能吞噬EB,把EB包裹在類(lèi)免疫細(xì)胞

8、中,防止對(duì)蛞蝓體的毒害,而且發(fā)現(xiàn)隨著蛞蝓體移動(dòng),含EB的細(xì)胞團(tuán)留在遺棄的粘液鞘中,最終將毒物脫出體外。表明在動(dòng)物進(jìn)化到多細(xì)胞之前,有覓食功能的單細(xì)胞低等真核生物已經(jīng)具備有防御能力。通過(guò)流式細(xì)胞儀的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),這些類(lèi)免疫細(xì)胞主要來(lái)自于前柄細(xì)胞,猜想是前柄細(xì)胞中的一類(lèi)特殊細(xì)胞。目前我們只是在形態(tài)上和來(lái)源上對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行了研究,但對(duì)這類(lèi)類(lèi)免疫細(xì)胞的免疫相關(guān)蛋白,類(lèi)免疫細(xì)胞是在毒物誘導(dǎo)后產(chǎn)生還是毒物誘導(dǎo)前就已經(jīng)存在的,在毒物被排除后,類(lèi)免疫細(xì)