盤基網(wǎng)柄菌發(fā)育期間蛞蝓體的形態(tài)學(xué)以及類免疫細(xì)胞的研究.pdf

1、盤基網(wǎng)柄菌(Dictyostelium discoideum)隸屬原生動物,是一類社會阿米巴蟲,當(dāng)生長條件良好時,細(xì)胞會以二分裂方式來繁殖后代;當(dāng)生存環(huán)境惡劣時,進行多細(xì)胞發(fā)育,整個發(fā)育過程約需24 h,大致分4個階段:細(xì)胞聚集(aggregation)階段、細(xì)胞丘(mound)階段、蛞蝓體(slug)階段和子實體(fruiting body)階段。蛞蝓體可細(xì)分為“突起”時期、“蛞蝓”時期和“拔頂”時期。蛞蝓體階段的細(xì)胞分為前柄細(xì)胞和前

2、孢子細(xì)胞兩大類,前柄細(xì)胞又可分PstA細(xì)胞、PstB細(xì)胞、PstO細(xì)胞和PstAB細(xì)胞;前孢子細(xì)胞只有Psp細(xì)胞。到子實體階段前柄細(xì)胞發(fā)育成柄細(xì)胞,前孢子細(xì)胞發(fā)育成孢子細(xì)胞,一旦條件合適,孢子細(xì)胞萌發(fā)開始新生命周期,而柄細(xì)胞無論在什么條件下都不能萌發(fā),因此柄細(xì)胞是凋亡細(xì)胞?？梢?盤基網(wǎng)柄菌細(xì)胞發(fā)育和高等生物發(fā)育相似,同樣存在著細(xì)胞分化和細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。蛞蝓體時期是細(xì)胞分化和細(xì)胞開始衰退的起始階段。由于受到環(huán)境影響及其個體大小存在差異,蛞蝓

3、體的個體發(fā)育的并不是完全同步的,但整個蛞蝓體階段只有兩個小時,故以往都把蛞蝓體看成一個時期,蛞蝓體具體的形態(tài)發(fā)育過程卻未見報道。由于各類細(xì)胞運動速度不同,蛞蝓體形態(tài)發(fā)生了巨大的變化。本工作用吖啶橙(Acridine orange,AO)和Hoechst33342(HO)兩種活體熒光染料,在盤基網(wǎng)柄菌細(xì)胞發(fā)育活體狀念下,通過熒光顯微鏡觀察盤基網(wǎng)柄菌細(xì)胞的分化情況,以期了解盤基網(wǎng)柄菌細(xì)胞發(fā)育,特別是蛞蝓體發(fā)育的具體過程及發(fā)育過程中出現(xiàn)的細(xì)胞

4、分化及凋亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn):占整個蛞蝓體近4/5細(xì)胞的細(xì)胞核在整個發(fā)育過程中始終都染成藍色,細(xì)胞未見衰退跡象,因此最終發(fā)育成孢子細(xì)胞。這與孢子細(xì)胞能夠萌發(fā),形成新的生命體是相符合的。而位于蛞蝓體前部,占整個蛞蝓體1/5細(xì)胞的細(xì)胞核隨著發(fā)育進程,細(xì)胞核先被染成藍綠色,然后被染成綠色,再成橙色,直到最后顯不出顏色。發(fā)育至蛞蝓體后期時,在蛞蝓體內(nèi)部可看到一“通道”,“通道”內(nèi)部被染成綠色,在發(fā)育成子實體時候,在“通道”內(nèi)部可見淺藍綠色的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)

5、,并且蛞蝓體時期的“通道”位置與子實體時期的柄的位置一致,由此推測,子實體的柄極有可能是“通道”發(fā)育而來的。這些數(shù)據(jù)提示從蛞蝓體前期開始,前柄細(xì)胞就已經(jīng)開始凋亡,但細(xì)胞并不是馬上死亡,而是一個漸進的凋亡過程,細(xì)胞核的功能一開始并不是完全消失,而是隨著細(xì)胞凋亡進程,逐漸喪失其功能,前柄細(xì)胞徹底凋亡后其細(xì)胞核才徹底喪失。因此按照染色的結(jié)果來看,蛞蝓體前柄細(xì)胞發(fā)育至少可分成4個時期,藍綠色期、綠色期、橙色期和無色期。因此可以通過細(xì)胞核著色不同

6、,來了解具體形態(tài)發(fā)育過程及其細(xì)胞的衰退程度,這為以后研究盤基網(wǎng)柄菌的發(fā)育提供依據(jù)。在實驗過程中,筆者發(fā)現(xiàn)當(dāng)Hoechst33342的濃度高于10μg/mL時,不再僅僅染活細(xì)胞的細(xì)胞核,會引起細(xì)胞死亡或引起細(xì)胞發(fā)生某些應(yīng)急反應(yīng),即對盤基網(wǎng)柄菌產(chǎn)生毒性效應(yīng)。在蛞蝓體階段會出現(xiàn)一類吞噬Hoechst33342有毒物質(zhì)的細(xì)胞。這類有特殊的功能細(xì)胞與高等生物的的免疫細(xì)胞功能相似,也有解毒和免疫樣活性,筆者稱之為類免疫細(xì)胞。為了進一步驗證類免疫細(xì)胞

7、的存在,實驗中用熒光染料EB作為盤基網(wǎng)柄菌生長環(huán)境中所遇毒物的替代品,通過熒光顯微鏡觀察,激光共聚焦顯微鏡觀察定位以及流式細(xì)胞儀來確定類免疫細(xì)胞的所處細(xì)胞群及其所占細(xì)胞比例。已知EB除了有毒外還可以穿過受損細(xì)胞膜對細(xì)胞核著色,我們先通過熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察定位實驗后發(fā)現(xiàn),EB并不是定位在細(xì)胞核中,因而說明其不是與DNA結(jié)合而顯色的,而是被包裹在細(xì)胞內(nèi)。通過熒光顯微鏡觀察研究發(fā)現(xiàn)類免疫細(xì)胞不但能吞噬EB,把EB包裹在類免疫細(xì)胞

8、中,防止對蛞蝓體的毒害,而且發(fā)現(xiàn)隨著蛞蝓體移動,含EB的細(xì)胞團留在遺棄的粘液鞘中,最終將毒物脫出體外。表明在動物進化到多細(xì)胞之前,有覓食功能的單細(xì)胞低等真核生物已經(jīng)具備有防御能力。通過流式細(xì)胞儀的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),這些類免疫細(xì)胞主要來自于前柄細(xì)胞,猜想是前柄細(xì)胞中的一類特殊細(xì)胞。目前我們只是在形態(tài)上和來源上對這些細(xì)胞進行了研究,但對這類類免疫細(xì)胞的免疫相關(guān)蛋白,類免疫細(xì)胞是在毒物誘導(dǎo)后產(chǎn)生還是毒物誘導(dǎo)前就已經(jīng)存在的,在毒物被排除后,類免疫細(xì)