盤基網柄菌多細胞發(fā)育期間與gp150蛋白相互作用蛋白的研究.pdf

1、盤基網柄菌(Dictyostelium discoideum)是一種低等的單細胞真核生物，在營養(yǎng)豐富的條件下能夠依靠吞噬細菌為食，其繁殖生長是通過二分裂的方式。當食物逐漸耗盡后，單個細胞逐漸聚集成多細胞體，歷經細胞聚集階段、細胞丘階段和蛞蝓體階段、最終發(fā)育成一個由孢子細胞和柄細胞組成的多細胞有機體-子實體階段。在合適條件下，孢子細胞能夠萌發(fā)，從而開始新的生命周期。盤基網柄菌的基因組是單倍體，不會由于等位基因的存在而掩蓋單基因的突變，因此

2、隱性性狀很容易鑒別，擁有非常豐富的突變型細胞。盤基網柄菌發(fā)育周期短，整個周期約需24h，各階段的特征也很清楚，且涉及到一系列生化過程與高等生物十分相似。由于具有以上優(yōu)點，盤基網柄菌可以作為非常好的模式動物，在研究細胞與細胞間的相互作用以及細胞黏附分子對發(fā)育的影響中發(fā)揮重要作用。
　　 盤基網柄菌中l(wèi)agC基因編碼的gpl50蛋白是一種細胞表面粘附分子，對多細胞發(fā)育和細胞分化極為重要。gpl50缺失的細胞株AK127的發(fā)育只能停留

3、在細胞松散聚集階段，不能完成多細胞發(fā)育。由此推測，gpl50蛋白在盤基網柄菌發(fā)育過程中起著重要作用。在細胞分化過程中，gpl50蛋白的分布存在著差異：在分化成孢子細胞的前孢子區(qū)內基本沒有gpl50蛋白分布；而在分化成柄細胞的前柄細胞區(qū)則有gpl50蛋白分布，并隨著發(fā)育進程逐漸增加。粘附分子gpl50能傳遞細胞內外的信號，但是目前為止只有少數關于gpl50蛋白參與盤基網柄菌細胞內相關信號通路的報道，其具體的信號通路至今仍未完全清楚。為此我

4、們克隆表達了gpl50蛋白C末端，并用純化的目的蛋白制備多克隆抗體，通過免疫共沉淀技術得到多個與gpl50分子相關的蛋白，其中兩個經質譜鑒定分別為40S ribosomal protein S3(RPS3)蛋白和40S ribosomal protein S24蛋白(RPS24)。
　　 本論文將含有gpl50蛋白c末端基因的pET-32a載體轉化入表達菌株大腸桿菌BL21(DE3)中，利用lmmol/L的IPTG誘導表達，最終

5、得到表達量較高的存在于包涵體中的融合蛋白。用8mol/L的尿素溶解包涵體后，裂解液經NI-NTA親合層析純化融合蛋白，最終得到的gpl50融合蛋白純度達90％以上。利用純化得到的gpl50蛋白作為抗原免疫家兔，從而獲得含有抗gpl50蛋白的多克隆抗體的抗血清。用Western blot檢測抗體的特異性，抗血清能特異地和目的蛋白結合，而對照血清與抗原沒有雜交帶；用問接ELISA法測定抗體的效價，達到1:128000以上，這證明我們制備的多

6、克隆抗體具有較高的效價和較好的特異性，為下一步的研究工作提供了工具。
　　 為了探索盤基網柄菌中與gpl50蛋白相互作用的其他蛋白，我們以發(fā)育至16h的盤基網柄菌為材料，在非變性的條件下提取總蛋白，將制備的抗gpl50的多克隆抗體及Protein A-Agarose加入到總蛋白提取物中。4℃振蕩過夜，離心分離抗原抗體復合物，經SDS-PAGE電泳分析得到七條相關蛋白條帶，其分子量大約在30KD-15KD左右。我們從中選取了較為清

7、晰的兩條條帶（分子量分別為25KD和14KD左右）進行質譜分析鑒定，結果分別為40S ribosomal protein S3(RPS3)蛋白和40S ribosomal protein S24蛋白(RPS24)。通過查閱相關文獻，我們發(fā)現兩蛋白在細胞周期調控、細胞發(fā)育及凋亡過程中有著重要作用。實驗結果提示在盤基網柄菌多細胞發(fā)育中gpl50蛋白可能與RPS3和RPS24發(fā)生相互作用，借此調節(jié)了盤基網柄菌細胞的發(fā)育與分化過程。