二氫楊梅素激活A(yù)MPK對(duì)高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的抑制作用研究.pdf

1、最新研究資料顯示我國(guó)18歲以上成年人糖尿病(diabetes mellitus，DM)的患病率高達(dá)11.6％，已成為繼心腦血管疾病和腫瘤之后嚴(yán)重威脅我國(guó)居民健康的“第三殺手”。糖尿病患者常常由于其各種并發(fā)癥而導(dǎo)致病殘和死亡，其中最為常見(jiàn)的原因是血管病變，而血管內(nèi)皮細(xì)胞遭受高糖損傷是發(fā)生糖尿病血管并發(fā)癥的始動(dòng)因素?；诖耍瑖?yán)格控制血糖水平是防治糖尿病血管并發(fā)癥的首選策略，然而現(xiàn)實(shí)生活中糖尿病患者的血糖控制有效率普遍偏低。因此，深入研究高糖

2、損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用機(jī)制及相應(yīng)的保護(hù)措施具有重要的理論價(jià)值和應(yīng)用前景。
　　大量研究證據(jù)表明單磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是防治糖脂代謝紊亂相關(guān)疾病的重要靶點(diǎn)，近年研究還發(fā)現(xiàn)AMPK信號(hào)通路對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能也有重要調(diào)節(jié)作用。AMPK是由催化亞基α和調(diào)節(jié)亞基β、γ組成的異源三聚體。AMPK上游激酶通過(guò)磷酸化α亞基的172位蘇氨酸殘基(Thr172)激活A(yù)MPK。研究發(fā)

3、現(xiàn)糖原可通過(guò)結(jié)合β亞基上的糖原結(jié)合域(glycogen-bindingdomain，GBD)，引起AMPK活性的變構(gòu)抑制。糖原合成酶(glycogen synthase，GS)是調(diào)控糖原合成的關(guān)鍵酶，而蛋白激酶B(Akt)、糖原合成酶激酶3β(glycogen synthasekinase-3β，GSK3β)對(duì)GS活性具有重要調(diào)控作用。γ亞基可通過(guò)感知細(xì)胞內(nèi)AMP/ATP比值的變化從而引起AMPK活性的變構(gòu)調(diào)節(jié)。已有研究發(fā)現(xiàn)高糖對(duì)心肌細(xì)

4、胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞的損傷作用與其抑制上述細(xì)胞的AMPK活性密切有關(guān)。但是，AMPK在高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的變化及其作用目前尚不清楚。
　　藤茶(ampelopsis grossedentata)屬于葡萄科植物家族中的分支蛇葡萄屬，既可泡茶飲用又具藥理作用，在我國(guó)中南部的山區(qū)分布較廣，當(dāng)?shù)厣贁?shù)民族將鮮嫩的藤茶莖葉炮制后飲用已有幾百年的歷史，并發(fā)現(xiàn)其對(duì)上呼吸道感染及肝炎等病癥有治療作用。黃酮類(lèi)化合物二氫楊梅素的含量在干藤茶中的比重高

5、達(dá)25％左右，二氫楊梅素已被證實(shí)具有改善脂類(lèi)代謝和對(duì)抗炎癥、腫瘤等多種藥理功效，同時(shí)也是藤茶作為保健飲品發(fā)揮作用的主要活性成分。在前期實(shí)驗(yàn)研究中證實(shí)楊梅素對(duì)高糖促發(fā)的血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用。而二氫楊梅素的分子結(jié)構(gòu)又與楊梅素極為相似，由此推測(cè)二氫楊梅素對(duì)高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷可能也具有保護(hù)效應(yīng)。
　　本研究通過(guò)高糖處理原代人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelialcells，

6、HUVECs)建立高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷體外模型，通過(guò)細(xì)胞活力測(cè)定、流式細(xì)胞分析、蛋白免疫印跡、蒽酮-硫酸比色法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、化學(xué)發(fā)光、ELISA等技術(shù)，探討AMPK活性變化在高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用及其調(diào)節(jié)機(jī)制，以及二氫楊梅素干預(yù)對(duì)高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用與機(jī)制，旨在為應(yīng)用二氫楊梅素干預(yù)或飲用藤茶防治糖尿病血管并發(fā)癥提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
　　主要研究結(jié)果和結(jié)論如下:
　　1、在高糖作用下，HUVEC

7、s細(xì)胞活力明顯下降，細(xì)胞凋亡率顯著增加，而二氫楊梅素干預(yù)可明顯抑制高糖誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞活力下降和細(xì)胞凋亡增加，表明二氫楊梅素對(duì)高糖誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞損傷有明顯的保護(hù)作用。
　　2、高糖處理的HUVECs細(xì)胞中AMPK及其下游靶蛋白ACC的磷酸化水平(p-AMPK、p-ACC)顯著降低，表明高糖抑制HUVECs細(xì)胞的AMPK活性。AMPK激動(dòng)劑AICAR預(yù)處理可顯著抑制高糖誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞活力下降及細(xì)胞凋亡增加;相反，

8、AMPK活性抑制劑compound C則明顯抵消AICAR對(duì)高糖誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞活力下降及細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用，提示AMPK活性抑制參與了高糖誘導(dǎo)HUVECs損傷。
　　3、與正常對(duì)照HUVECs細(xì)胞相比，二氫楊梅素處理的HUVECs細(xì)胞中的p-AMPK、p-ACC水平顯著升高，且高糖處理的HUVECs細(xì)胞經(jīng)二氫楊梅素干預(yù)后p-AMPK、p-ACC水平明顯回升，表明二氫楊梅素可拮抗高糖對(duì)HUVECs細(xì)胞AMPK活性的抑制作用。

9、此外，AMPK活性抑制劑compound C明顯削弱二氫楊梅素對(duì)高糖誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，提示二氫楊梅素通過(guò)激活A(yù)MPK抑制高糖誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞損傷。
　　4、高糖處理的HUVECs細(xì)胞與正常對(duì)照組細(xì)胞相比，細(xì)胞內(nèi)糖原含量顯著增加，GSmRNA及蛋白表達(dá)明顯升高，同時(shí)Akt和GSK3β蛋白的表達(dá)及其磷酸化水平增加，提示高糖可能通過(guò)Akt-GSK3β-GS通路促進(jìn)HUVECs細(xì)胞糖原合成繼而抑制AMPK活性。

10、r>　　5、二氫楊梅素處理的HUVECs與正常對(duì)照組細(xì)胞比較，細(xì)胞內(nèi)ATP含量顯著降低，同時(shí)ATP合成酶線粒體酶復(fù)合物F1F0-ATP合成酶活性明顯下降，提示二氫楊梅素可能通過(guò)抑制ATP合成酶活性降低細(xì)胞內(nèi)ATP的含量，繼而激活A(yù)MPK。
　　綜上所述，高糖通過(guò)Akt-GSK3β-GS通路增加HUVECs細(xì)胞內(nèi)糖原含量抑制其AMPK活性，繼而引起HUVECs細(xì)胞損傷，而二氫楊梅素干預(yù)可通過(guò)抑制HUVECs細(xì)胞線粒體酶復(fù)合物F1F0