EYFP-H148Q-I152L-HeLa細胞篩查模型的建立及應(yīng)用.pdf

1、研究背景:
　　氯、碘、溴等陰離子（鹵素）是維持人體細胞內(nèi)環(huán)境及發(fā)揮正常功能的重要成分。細胞質(zhì)膜對水及各種離子的動態(tài)平衡，依賴于細胞膜上各種通道蛋白及轉(zhuǎn)運體的作用。而陰離子的跨膜轉(zhuǎn)運參與了細胞的容積調(diào)節(jié)、遷移、增殖、凋亡、以及細胞內(nèi)外環(huán)境pH的調(diào)節(jié)等各種生物活動過程[1]。特別是在各種病理性損傷過程中，當(dāng)發(fā)生細胞腫脹等內(nèi)外液滲透壓的改變時，陰離子通過離子通道、轉(zhuǎn)運體等方式完成離子在細胞膜內(nèi)外的交換，起著重要的調(diào)節(jié)作用[2]。本課題

2、組前期在staurosporine、缺血再灌注損傷及衣霉素分別通過線粒體、凋亡受體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等途徑構(gòu)建的心肌細胞凋亡模型上，發(fā)現(xiàn)陰離子通道參與了細胞的凋亡過程，應(yīng)用特異性阻斷劑DCPIB和非特異性阻斷劑DIDS能有效抑制細胞凋亡性死亡，特別是在體心臟中能夠減少梗死面積、改善心臟功能、抑制心律失常的發(fā)生，達到保護受損心臟的作用[3-5]。然而，目前有關(guān)陰離子通道阻斷劑的使用僅保留在實驗室水平、且種類數(shù)量較少，藥品均為國外試劑公司所壟斷。

3、為此，我們的目的就是通過在已知的天然化合物庫中篩查出具有自主知識產(chǎn)權(quán)的目的化合物。而如何尋找一種具有高效的、低成本的、天然化合物篩查技術(shù)顯得非常迫切與重要。
　　為了能夠?qū)ふ业揭环N高效、便捷、低成本的天然化合物篩選的方法，通過大量文獻檢索，研究報道發(fā)現(xiàn)黃色熒光蛋白（yellow fluorescent protein，YFP）的熒光改變可以作為信號顯示細胞內(nèi)陰離子濃度的變化[6,7]。增強型黃色熒光蛋白（enhancedyello

4、w fluorescent protein，EYFP），由于其pKa值高、對鹵化物更敏感[8]，并能被I-離子淬滅[9]，近年來被廣泛應(yīng)用到消化道分泌細胞、神經(jīng)細胞及腫瘤細胞等的陰離子變化的研究。
　　本研究擬應(yīng)用基因重組技術(shù)構(gòu)建搭載EYFP突變蛋白（EYFP-H148Q/I152L）基因的慢病毒載體，感染HeLa細胞，建立穩(wěn)定的細胞模型作為陰離子（鹵素）通道阻斷劑的篩查模型；并應(yīng)用構(gòu)建的EYFP-H148Q/I152L-HeLa

5、細胞篩查模型，對眾多的天然化合物進行高通量篩查及評估。
　　研究目的:
　　1.構(gòu)建穩(wěn)定表達突變熒光蛋白EYFP（EYFP-H148Q/I152L）的HeLa細胞作為陰離子（鹵素）通道阻斷劑篩選的細胞模型。
　　2.應(yīng)用EYFP-H148Q/I152L-HeLa細胞篩查模型，對天然化合物進行高通量篩查，初步篩選出候選化合物，并對該模型進行評估。
　　實驗方法:
　　1.基因重組技術(shù)構(gòu)建表達EYFP突變蛋白（

6、EYFP-H148Q/I152L）和puromycin抗性的慢病毒載體。
　　2.慢病毒載體和包裝質(zhì)?；旌衔镌?93T細胞內(nèi)的擴增、慢病毒顆粒感染HeLa細胞。
　　3.應(yīng)用puromycin抗性基因?qū)δ康募毎暮Y選、純化，構(gòu)建穩(wěn)定表達EYFP突變蛋白的細胞系。
　　4.用Real Time-PCR和Western Blot對目的基因EYFP-H148Q/I152L檢測鑒定并擴增目的細胞。
　　5.應(yīng)用FLIPR

7、 TETRA實時高通量熒光成像分析儀，進行天然化合物的篩選。
　　6.實驗分為4組：低滲I-溶液為陰性對照組，等滲Cl-為陽性對照組，低滲I-溶液+DIDS組為標(biāo)準(zhǔn)參照組，及低滲I-溶液+化合物組為實驗組。
　　7.評估高通量篩查模型公式：信噪比(Signal/Background Ratio，S/B)=信號平均值/本底平均值；Z’因子=1-(3×信號標(biāo)準(zhǔn)差+3×本底標(biāo)準(zhǔn)差)/｜信號平均值-本底平均值｜
　　8.天然化

8、合物的高通量篩查活性數(shù)據(jù)的處理公式：阻斷化合物反應(yīng)率=(待測化合物值-陽性對照值)/(陰性對照值-陽性對照值)×100％；阻斷活性=1-阻斷化合物反應(yīng)率。
　　實驗結(jié)果:
　　1.通過基因重組技術(shù)將表達EYFP-H148Q/I152L片段成功插入到慢病毒載體中，目的基因序列通過基因測序技術(shù)得到證實。
　　2.慢病毒顆粒成功感染HeLa細胞，應(yīng)用puromycin抗性基因，完成了目的細胞的篩選、純化及單克隆擴增。

9、　　3.Real Time-PCR和Western Blot檢測顯示：目的基因在HeLa細胞中實現(xiàn)了過表達（P＜0.05，n=8）。
　　4.熒光顯微鏡下可以觀察到EYFP-H148Q/I152L-HeLa穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株能夠表達特有的黃色熒光，效率接近100%。
　　5.陰性對照組（低滲I-溶液），細胞發(fā)生明顯熒光淬滅；等滲I-溶液組，細胞發(fā)生輕微熒光淬滅；二組比較有顯著性差異（P＜0.01，n=16）。
　　6.陽性對照

10、組（等滲Cl-溶液），細胞無熒光淬滅。陰性對照組與陽性對照相比，二組熒光強度比較有顯著性差異（P＜0.01，n=16）。
　　7.標(biāo)準(zhǔn)參照組（低滲 I-溶液+DIDS組）熒光淬滅減弱，與陰性對照組相比，二組間熒光強度比較有顯著性差異（P＜0.01，n=16）。
　　8.標(biāo)準(zhǔn)參照組DIDS濃度梯度實驗，最后確定500μmol/L、50%的阻斷效率標(biāo)準(zhǔn)作為天然化合物的篩選標(biāo)準(zhǔn)。通過接種不同細胞密度、不同接種時間，獲得最佳實驗條件

11、：2.5萬/100μL細胞密度及鋪板24h后檢測熒光值最佳。
　　9.以等滲NaCl組、低滲NaI組，在高通量篩選儀上進行 Z’因子，信噪比（Signal to Noise Ratio，SNR），來評估篩選模型；通過公式計算得到Z’因子為0.53，信噪比為5.14，提示該細胞模型穩(wěn)定性、特異性及敏感性符合高通量篩選標(biāo)準(zhǔn)。
　　10.在上述實驗條件下，通過設(shè)立陰性、陽性及標(biāo)準(zhǔn)參照組，與6988種天然化合物組熒光強度比較，第一次

12、篩選獲得425種陽性結(jié)果；為了進一步提高陽性率，對上述425種化合物進行第二重復(fù)篩選，獲得200種陽性結(jié)果；對上述200種化合物進行第三重復(fù)篩選，獲得7種陽性化合物。
　　實驗結(jié)論:
　　1.成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達EYFP-H148Q/I152L-HeLa細胞系，對I-低滲刺激發(fā)生明顯的熒光淬滅，是一種穩(wěn)定、高效、理想的陰離子（鹵素）通道阻斷劑篩查模型。
　　2.確立了標(biāo)準(zhǔn)參照藥DIDS最佳實驗濃度及判斷標(biāo)準(zhǔn)，分別是500