人鼻型NK-T細(xì)胞淋巴瘤裸鼠模型的建立及人類表達(dá)譜cDNA芯片篩查的研究.pdf

1、鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤(NasaltypeNK/Tcelllymphoma)是一類具有特殊形態(tài)、免疫表型和生物學(xué)行為，多原發(fā)于淋巴結(jié)外器官或組織，存在高水平EB病毒感染的腫瘤。該腫瘤常表達(dá)T細(xì)胞分化抗原及自然殺傷(NaturalKiller，NK)細(xì)胞相關(guān)抗原，其確切細(xì)胞屬性尚有爭議，故得此名。新版WHO關(guān)于淋巴造血組織腫瘤的分類已將其列為一個(gè)獨(dú)立的淋巴瘤類型。鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤在亞洲及南美洲發(fā)病率較高，西歐和北美地區(qū)少見，故該腫瘤

2、是亞洲、也是中國的“特產(chǎn)”。四川大學(xué)華西醫(yī)院病理科每年診斷該類腫瘤60余例，約占所有淋巴瘤的18.75％，占非霍奇金淋巴瘤的20％左右。 鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤多發(fā)于中線面部，局部活檢組織多較小，除做病理診斷和免疫表型檢測外所剩無幾，故實(shí)驗(yàn)材料的匱乏是制約對(duì)該腫瘤深入研究的主要障礙。因此，建立人鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤裸鼠模型和細(xì)胞系是獲取豐富穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)該腫瘤進(jìn)行深入研究的主要途徑。到目前為止，國外僅有少數(shù)幾個(gè)鼻型NK/T

3、細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系的報(bào)道。在國內(nèi)外尚未見到有關(guān)該腫瘤動(dòng)物模型建成的報(bào)道。 腫瘤是一類基因病，腫瘤的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的多階段過程，多種因素引起癌基因的激活或抑癌基因的失活在許多腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中扮演著重要的角色?；蛐酒?Genechip)技術(shù)是近年發(fā)展起來的一種高科技分子生物學(xué)手段，是一種高通量、快速、平行核酸序列測定及定量分析技術(shù)。高密度cDNA表達(dá)譜基因芯片已用于人類多種腫瘤的差異性表達(dá)基因的篩查研究，如Alizadeh等(20

4、00)對(duì)一組組織形態(tài)、免疫表型、臨床表現(xiàn)和治療反應(yīng)均異的彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤進(jìn)行分類的研究等。Oka等(2001)年也利用該技術(shù)對(duì)NK/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系NK-YS進(jìn)行了酪氨酸蛋白磷酸酶家族基因表達(dá)變化研究，發(fā)現(xiàn)酪氨酸蛋白磷酸酶-1(Src-Homologydomain2-containingProteinTyrosinePhosphatase-1，SHP-1)基因表達(dá)明顯下調(diào)，推測該基因表達(dá)的變化可能與該類腫瘤的發(fā)病有關(guān)。除此而外，尚未

5、見到其它相關(guān)的研究報(bào)道。 本研究嘗試建立人鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤的裸鼠模型及其細(xì)胞系，并用含4096條人類靶基因的表達(dá)譜cDNA芯片對(duì)人鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤腫瘤組織進(jìn)行基因差異表達(dá)的篩查；同時(shí)還用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及免疫組織化學(xué)技術(shù)對(duì)供體人鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤的原發(fā)瘤及繼發(fā)瘤、裸鼠移植瘤，以及一組鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤病例進(jìn)行了SHP-1基因轉(zhuǎn)錄與蛋白表達(dá)水平的檢測。旨在建立穩(wěn)定的人鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤裸鼠模型及其細(xì)胞系，

6、初步了解在人鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤發(fā)生差異性表達(dá)的基因數(shù)量及其功能，并探討SHP-1基因轉(zhuǎn)錄與蛋白表達(dá)水平的變化與該腫瘤發(fā)生的可能關(guān)系。 主要研究結(jié)果如下：1.建立人鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤裸鼠模型的工作選擇人鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤胃繼發(fā)瘤瘤組織，通過裸鼠移植并傳代，經(jīng)過近兩年的嘗試，初步建成該腫瘤的裸鼠模型。該移植瘤從病理形態(tài)、免疫表型、基因型、EBV感染，以及種屬等方面均與人鼻腔原發(fā)瘤和胃轉(zhuǎn)移瘤一致。移植瘤現(xiàn)已傳至第十四代，生

7、長周期逐漸縮短并穩(wěn)定，其中潛伏生長期1周，緩慢生長期1周，快速生長期1周，移植成活率與液氮凍存復(fù)蘇率為100％，體外細(xì)胞培養(yǎng)生長穩(wěn)定。相關(guān)工作仍在繼續(xù)進(jìn)行，希望最終建成較理想的人鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤裸鼠模型和腫瘤細(xì)胞系。 2.人類表達(dá)譜cDNA芯片篩查的研究用含4096條人類靶基因的表達(dá)譜cDNA芯片對(duì)裸鼠移植瘤供體—人胃繼發(fā)鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤的腫瘤組織與正常人外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行基因差異表達(dá)的篩查，檢出差異表達(dá)基因256條

8、，有178條表達(dá)下調(diào)，87條表達(dá)上調(diào)；其中有25條呈下調(diào)表達(dá)的基因和21條呈上調(diào)表達(dá)的基因與該腫瘤密切相關(guān)。進(jìn)一步分析這些基因的功能，其表達(dá)的變化可能與該腫瘤的某些生物學(xué)行為有關(guān)，如腫瘤壞死，腫瘤細(xì)胞浸潤血管，以及侵襲性等。核糖體蛋白基因與SHP-1基因的下調(diào)可能是人鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤的重要事件。 3.SHP-1基因轉(zhuǎn)錄與蛋白表達(dá)水平的檢測用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及免疫組織化學(xué)技術(shù)對(duì)供體人鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤的原發(fā)瘤及繼發(fā)瘤、

9、裸鼠移植瘤，以及15例鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤進(jìn)行了SHP-1基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測，并對(duì)27例該腫瘤病例進(jìn)行了SHP-1蛋白表達(dá)的檢測。結(jié)果示所有樣本的SHP-1mRNA表達(dá)均明顯下調(diào)，其瘤細(xì)胞均不表達(dá)SHP-1蛋白，與基因芯片的檢測結(jié)果一致。 綜上所述，本研究直接將人鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤成功進(jìn)行了裸鼠移植和傳代，初步建立了該腫瘤的裸鼠模型，到目前為止，在國內(nèi)外尚未見報(bào)道。人鼻型NK/T細(xì)胞淋巴瘤存在多條差異表達(dá)基因，后者可能與該