短肢畸形致病基因篩查方法建立和產(chǎn)前診斷應(yīng)用.pdf

1、背景：
　　出生缺陷在我國每年的發(fā)生率高達4-6％。胎兒骨骼發(fā)育異常是常見的出生缺陷之一，其致病機制，涉及400多個致病基因突變，分布于細胞外基質(zhì)、已知的信號通路、細胞骨架成分、鈣-磷代謝、轉(zhuǎn)錄因子、脂類合成、破骨細胞相關(guān)基因、溶酶體水解酶等，導(dǎo)致456種骨病發(fā)生。其中80余種基因突變與生長板發(fā)育相關(guān)，引起長骨發(fā)育異常造成短肢畸形。目前臨床上依賴B超檢查在孕晚期可以發(fā)現(xiàn)部分的胎兒骨骼系統(tǒng)發(fā)育異常，但超聲診斷無法明確疾病類型，故對相

2、關(guān)致病基因的檢測意義重大。某些短肢畸形，在胎兒時期并無臨床癥狀，孕期產(chǎn)前超聲檢查并未發(fā)現(xiàn)異常，出生2-3年后才出現(xiàn)臨床表現(xiàn)，并逐漸加重，如假性軟骨發(fā)育不全，故對先證者基因篩查用于下一胎產(chǎn)前診斷成了唯一診斷途徑。如何快速、便宜、敏感、準確地對短肢畸形先證者或超聲檢查提示異常的胎兒進行致病基因篩查是目前研究難題，熱點突變篩查是常用策略，如短肢畸形中，軟骨發(fā)育不全與FGF信號通路相關(guān)，F(xiàn)GF受體FGFR3基因G1138A的熱點突變成為98％軟

3、骨發(fā)育不全的致病原因，故為短肢畸形的首選分子檢測靶標;低磷酸酶血癥與堿性磷酸酶基因ALPL突變相關(guān)，突變達250多種，熱點突變集中在5-6和9-12外顯子區(qū)域。但重癥低磷酸酶血癥與ALPL基因多點突變關(guān)聯(lián)，熱點突變檢測可能導(dǎo)致重癥患者誤診，全基因掃描更適合臨床;COL1A1、COL1A2是成骨不全的致病基因，大小分別為50kb和60kb，并由50和52個外顯子組成，分子診斷較困難;大部分短肢畸形臨床無法明確分型，致病基因聯(lián)合檢測是提供臨

4、床診斷的重要依據(jù)。
　　目的：本研究采用Sanger測序法、靶基因捕獲高通量測序方法，針對本中心收集的短肢畸形先證者或胎兒進行致病基因熱點突變篩查或全基因組靶基因篩查，分析突變位點與臨床表型關(guān)聯(lián)性，對未明確位點進行細胞學(xué)研究，獲得致病性依據(jù);初步了解本區(qū)域短肢畸形發(fā)生的致病基因譜，目的是建立適合臨床應(yīng)用的靶基因全序列檢測方案，為遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷提供理論依據(jù)。
　　方法：收集2012年9月至2014年12月間來我院進行遺傳和

5、產(chǎn)前咨詢的患者。根據(jù)臨床咨詢、臨床表型、X光檢測、B超檢查診斷為短肢畸形患者31例，均為散發(fā)病例。其中8例為先證者，男性患者5例，平均年齡16.4歲，女性患者3例，平均年齡20歲，其中2例為孕婦，為遺傳咨詢，尋求產(chǎn)前診斷前來就診;其余23例為胎兒，孕婦孕周在16-33周，平均年齡為32歲，因超聲診斷短肢畸形要求產(chǎn)前診斷。本研究首先采用熱點突變篩查方法，合成FGFR3基因G380R、R248C位點引物，PCR擴增，Sanger測序篩查特異

6、突變位點;然后根據(jù)臨床表型，合成ALPL基因12個編碼外顯子及兩側(cè)內(nèi)含子引物，PCR擴增，Sanger測序法逐一明確ALPL基因的雙點突變位置;對疑似成骨不全患者或臨床無法確診的8個病例，利用NimbleGen芯片固相捕獲COL1A1、COL1A2、CRTAP、LC26A2、COMP、COL9A1、COL9A2、COL9A3、ATN、 FGFR2、FGFR3、SLC35D1、IDS、IDUA基因，illumina Hiseq2000測序

7、，獲取數(shù)據(jù)分析比對統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)靶基因突變位點，并嘗試對發(fā)現(xiàn)的MATN3基因突變位點進行細胞水平功能驗證。篩查到的已知致病位點均擴大父母檢測，以明確遺傳方式，為下一胎產(chǎn)前診斷提供依據(jù)。
　　結(jié)果：1、31例短肢畸形患者用熱點突變檢測出FGFR3基因G380R位點錯義突變7例(22.6％)，R248C位點錯義突變2例(6.4％)。用單基因Sanger測序法逐一外顯子測序檢測出ALPL基因R136H、V382I位點純合突變1例(3.2％)

8、。利用靶基因芯片捕獲高通量測序檢測出IDS基因R468Q位點突變1例(3.2％);COL1A2基因P857T位點突變1例、G727D位點突變1例(6.4％);MATN3基因R70H位點突變1例(3.2％)?？偖惓z出率為41.9％。
　　2、23例B超顯示短肢畸形胎兒中，F(xiàn)GFR3基因G380R位點突變5例，提示為軟骨發(fā)育不全;R248C位點突變2例，提示為短肢畸形伴胸廓畸形。兩位點突變陽性占短肢畸形的30.4％，均為新發(fā)病例。1

9、例孕婦為先證者的，胎兒產(chǎn)前診斷并未發(fā)生G380R突變。
　　3、先證者ALPL基因第4外顯子R136H突變，第9外顯子V382I突變，提示為低磷酸酶血癥，且來源于父母，第二胎胎兒產(chǎn)前基因檢測未見突變。
　　4、8例患者高通量測序結(jié)果顯示:1例為IDS基因R468Q純合突變，提示為粘多糖Ⅱ型。1例為MATN3基因R70H雜合突變，經(jīng)過SIFT蛋白功能預(yù)測為良性，而PolyPhen蛋白功能預(yù)測為有害的，疑似多發(fā)性骨骺發(fā)育不良5型

10、;2例為COL1A2基因P857T位點突變和G727D位點突變，均未見報道，正常人群中未見多態(tài)。
　　5、對疑似多發(fā)性骨骺發(fā)育不良5型MA TN3基因R70H雜合突變位點進行細胞功能學(xué)研究顯示，mRNA表達未見減少，需要進一步研究。
　　結(jié)論：小樣本研究顯示短肢畸形疾病譜以軟骨發(fā)育不全為主，其次為成骨不全、粘多糖病、多發(fā)性骨骺發(fā)育不良、低磷酸酶血癥等散發(fā)病例。短肢畸形致病基因篩查首先可使用熱點突變篩選方法對FGFR3基因檢測