擬南芥調(diào)控胚乳發(fā)育和種子大小的基因-IKU1的分離和功能研究.pdf

1、種子對(duì)人類來說,代表了食物和工業(yè)原料的重要來源。種子大小是影響作物產(chǎn)量的重要因素之一。而胚乳又占谷類植物種子的大部分體積,決定了種子的大小。因此,在當(dāng)前人口越來越膨脹、資源越來越緊缺的形勢(shì)下,加強(qiáng)對(duì)胚乳發(fā)育的研究,對(duì)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)乃至人類社會(huì)的科學(xué)可持續(xù)發(fā)展具有特別重大的戰(zhàn)略意義。
　　 前人研究(Garcia等;Luo等)表明,擬南芥早期胚乳和種子大小至少受到三個(gè)基因IKU1、IKU2和MINI3控制。它們的突變體均表現(xiàn)為胚乳數(shù)量

2、減少和種子變小。這三個(gè)基因作用于同一個(gè)遺傳途徑。IKU2編碼LRR受體激酶;MINI3編碼WRKY家族蛋白WRKY10,是調(diào)控胚乳增殖的轉(zhuǎn)錄因子。但對(duì)IKU1基因了解甚少。
　　 本文使用分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物信息學(xué)、生殖生物學(xué)的方法對(duì)與胚乳發(fā)育有關(guān)的擬南芥孢子體隱性突變體——iku1(haiku1)基因進(jìn)行了較為深入的研究。應(yīng)用了遺傳標(biāo)記定位技術(shù)、顯微鏡技術(shù)、蛋白研究技術(shù)、基因克隆、突變技術(shù)、生物信息學(xué)等技術(shù)來分

3、離IKU1基因、研究IKU1的功能,取得了突出進(jìn)展,為早期胚乳的發(fā)育和種子大小控制的機(jī)理貢獻(xiàn)了新的知識(shí),對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的小麥、水稻等種子發(fā)育研究有重要的參考價(jià)值。
　　 本研究利用遺傳標(biāo)記、PCR技術(shù)和基因測(cè)序技術(shù)把IKU1定位在At2g35230基因上。帶有At2g35230全部基因信息的互補(bǔ)載體彌補(bǔ)了iku1突變體的基因缺陷,使iku1突變體表現(xiàn)型恢復(fù)為野生型大種子。分析其T1、T2種子的表現(xiàn)型和基因型,從遺傳學(xué)角度證實(shí)了IK

4、U1基因功能發(fā)生在胚乳中,驗(yàn)證了擬南芥的卵細(xì)胞和中央細(xì)胞可以通過花器浸泡分別轉(zhuǎn)化。IKU1編碼的蛋白包含了植物中特有的VQmotif,在檢驗(yàn)IKU1蛋白功能區(qū)的遺傳互補(bǔ)試驗(yàn)中,帶有VQ motif突變的IKU1基因不能使iku1突變體種子恢復(fù)野生型大小,而刪除了重復(fù)區(qū)域45個(gè)氨基酸的突變?nèi)钥梢允雇蛔凅w種子恢復(fù)野生型大小,說明VQ motif對(duì)于IKU1基因影響種子發(fā)育的功能十分重要。高表達(dá)啟動(dòng)子35S作用下的GFP::IKU1蛋白在根尖

5、細(xì)胞、莖表皮細(xì)胞、葉片絨毛細(xì)胞、氣孔保衛(wèi)細(xì)胞、種皮細(xì)胞的細(xì)胞核以及洋蔥表皮細(xì)胞的細(xì)胞核中表達(dá),但核仁中沒有GFP信號(hào)。同時(shí),也發(fā)現(xiàn)35S::GFP::IKU1在其轉(zhuǎn)化株后代中,會(huì)出現(xiàn)基因沉默現(xiàn)象。而IKU1啟動(dòng)子作用下的GFP::IKU1仍具有IKU1在胚乳中的功能,可以使iku1突變體的種子恢復(fù)野生型性狀,同時(shí)也揭示了IKU1在植株中真實(shí)表達(dá)形式。其T1植株中,GFP::IKU1表達(dá)在根尖、莖表皮、花柄、莢果隔膜、種皮和中央細(xì)胞及受精

6、后不同階段的胚乳細(xì)胞細(xì)胞核中,但是蛋白表面沒有亮點(diǎn)(speckle),卵細(xì)胞和胚的細(xì)胞中也沒有GFP::IKU1信號(hào)。IKU1是一個(gè)未知功能的蛋白,它與Atlg32610及其它來自毛果楊、蓖麻、棉花、葡萄的VQ motif蛋白處于同一進(jìn)化組群。大多數(shù)編碼VQ motif蛋白的基因都沒有內(nèi)含子。Atlg32610與IKU1蛋白序列十分相似,它們某些功能的可能重疊也許導(dǎo)致我們觀察不到iku1突變體在種子以外的組織器官中的表現(xiàn)型。雙突變體種子

7、重量的分析結(jié)果說明了IKU1和MINI3作用于同一個(gè)影響種子發(fā)育的遺傳途徑。酵母雙雜交等試驗(yàn)結(jié)果也揭示,IKU1極可能與MINI3/WRKY10,一個(gè)WRKY家族的轉(zhuǎn)錄因子存在相互作用,形成蛋白復(fù)合體。
　　 在本試驗(yàn)和前人研究的基礎(chǔ)上,提出了一個(gè)關(guān)于IKU1-MINI3/WRKY10的種子發(fā)育途徑模式。在野生型植株中,IKU1、MINI3/WRKY10先形成蛋白復(fù)合體,由復(fù)合體參與調(diào)節(jié)一個(gè)控制種子大小的基因——IKU2,最終產(chǎn)