TNF-α誘導(dǎo)NG108-15細(xì)胞氧化應(yīng)激及對(duì)神經(jīng)性一氧化氮合酶表達(dá)的影響.pdf

1、目的：我們前期的研究表明，體循環(huán)中高表達(dá)的內(nèi)源性促炎性腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）在陰莖組織中可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激（Oxidative stress），促進(jìn)活性氧簇（ reactive oxygen species，ROS）生成，在外周組織參與了糖尿病性勃起功能障礙（erectile dysfunction，ED）的發(fā)病機(jī)制；同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)，TNF-α及其受體在雄性糖尿病大鼠下丘腦室旁核區(qū)

2、域的表達(dá)顯著上調(diào)，但目前尚無(wú)TNF-α在中樞內(nèi)調(diào)控糖尿病雄性性功能障礙發(fā)病機(jī)制的相關(guān)報(bào)道。本離體實(shí)驗(yàn)的研究目的在于：1）證明TNF-α可誘導(dǎo)NG108-15細(xì)胞（小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞×大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞之融合細(xì)胞）氧化應(yīng)激，描述ROS生成的變化特征；2）明確TNF-α誘導(dǎo)NG108細(xì)胞ROS生成的細(xì)胞內(nèi)來(lái)源與途徑，著重探討NADPH氧化酶在TNF-α誘導(dǎo)的ROS生成過(guò)程中相關(guān)亞基的表達(dá)變化；3）研究TNF-α誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激對(duì)NG108-

3、15細(xì)胞神經(jīng)性一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase，nNOS）表達(dá)的影響，從而提示TNF-α在中樞水平參與糖尿病男性性功能障礙發(fā)生發(fā)展的可能機(jī)制。
　　材料和方法：在體外選用分化NG108-15細(xì)胞，以不暴露TNF-α組為陰性對(duì)照組（NC），以Rosup（50μg/mL）或TNF-α（100pg/mL）處理12h為陽(yáng)性對(duì)照組（PC），以不同濃度（1，10，100，1000pg/mL）TNF-α

4、暴露處理不同時(shí)間（2，6，12，24h）為實(shí)驗(yàn)組，采用DCFH-DA染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS變化情況；應(yīng)用強(qiáng)效抗氧化劑NAC不同濃度（6，60，600，6000，60000μM）預(yù)處理細(xì)胞后，再以100pg/mL的TNF-α刺激12h以誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi) ROS變化情況；應(yīng)用NADPH氧化酶特異性抑制劑APO、DPI，線粒體特異性抑制劑ROT、MITO預(yù)處理細(xì)胞后，再以100pg/mL的TNF-α刺激12h以誘導(dǎo)氧

5、化應(yīng)激，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS變化情況；應(yīng)用qPCR技術(shù)分析（10，100，1000pg/mL）TNF-α刺激前后細(xì)胞內(nèi) NADPH氧化酶家族及其亞組分的基因表達(dá)水平變化；應(yīng)用Western blot方法檢測(cè)NOX2及其亞組分p47phox和Rac-1的表達(dá)；應(yīng)用Western blot檢測(cè)不同濃度（1，10，100，1000pg/mL）TNF-α處理對(duì)NG108-15細(xì)胞nNOS的表達(dá)的影響以及100pg/mL TNF-α聯(lián)合AP

6、O、DPI處理后細(xì)胞nNOS的表達(dá)變化。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1. TNF-α處理NG108-15細(xì)胞，與陰性對(duì)照組相比，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組ROS水平顯著升高（p<0.05），且隨著TNF-α處理時(shí)間和濃度的增加，實(shí)驗(yàn)組ROS熒光強(qiáng)度呈依賴性增強(qiáng)。
　　2.以NAC預(yù)孵育的實(shí)驗(yàn)組，與陽(yáng)性對(duì)照組相比，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組ROS生成顯著減少（p<0.05），且隨著NAC處理濃度的增加，實(shí)驗(yàn)組ROS熒光強(qiáng)度呈依賴性

7、減弱。
　　3.以線粒體電子傳遞鏈抑制劑ROT、線粒體活性氧清除劑Mito-TEMPO預(yù)孵育的實(shí)驗(yàn)組，與陽(yáng)性對(duì)照組相比，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示ROS熒光強(qiáng)度沒(méi)有差異（p>0.05）；以NADPH氧化酶特異性抑制劑DPI、APO預(yù)孵育的實(shí)驗(yàn)組，與陽(yáng)性對(duì)照組相比，ROS熒光強(qiáng)度顯著降低（p<0.05），而與陰性對(duì)照組無(wú)明顯差異（p>0.05）。
　　4.NG108-15細(xì)胞不表達(dá)NOX1，NOX4和p40phox，主要表達(dá)NOX2，

8、NOX3和亞組分p22phox、p47phox、p67phox和Rac-1。而經(jīng)TNF-α（10，100，1000pg/mL）刺激后，表達(dá)譜不發(fā)生變化，但是亞基基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生改變。其中NOX2、NOX3、p47phox和Rac-1無(wú)顯著改變（p>0.05），在一定的濃度范圍內(nèi)，p22phox、p67phox隨著TNF-α處理濃度的升高其mRNA表達(dá)水平都有不同程度的上調(diào)（p<0.05)。
　　5.TNF-α處理NG108-15細(xì)

9、胞，與陰性對(duì)照組相比，隨著TNF-α濃度的升高，細(xì)胞內(nèi)gp91phox，p47phox，Rac-1蛋白的表達(dá)呈劑量依賴性升高（p<0.05）。
　　6.TNF-α處理NG108-15細(xì)胞，與陰性對(duì)照組相比，1pg/mL的TNF-α對(duì)細(xì)胞內(nèi)nNOS的生成無(wú)顯著影響（p>0.05），但隨著TNF-α處理濃度的持續(xù)升高，nNOS蛋白的表達(dá)水平呈劑量依賴性降低（p<0.05）；而以NADPH氧化酶特異性抑制劑DPI、APO預(yù)孵育的細(xì)胞，與

10、陽(yáng)性對(duì)照組相比nNOS蛋白表達(dá)顯著降低（p<0.05），與陰性對(duì)照組無(wú)明顯差異（p>0.05）。
　　結(jié)論:TNF-α可顯著促進(jìn)NG108-15細(xì)胞內(nèi)ROS生成增加，提高胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平；ROS生成增加主要來(lái)源于胞內(nèi)NADPH氧化酶途徑；TNF-α主要通過(guò)上調(diào)NOX2及相關(guān)亞基的表達(dá)提升細(xì)胞氧化應(yīng)激水平；TNF-α可以顯著降低NG108-15細(xì)胞nNOS蛋白的表達(dá)，而NADPH氧化酶特異性抑制劑APO、DPI可以抑制上述效應(yīng)。以上