天然酚類物質(zhì)的葡萄糖醛酸化代謝及代謝物外排研究.pdf

1、目的：
　　天然酚類物質(zhì)具有抗氧化、抗炎及抗腫瘤等多種藥理活性，是一類極具藥物開(kāi)發(fā)潛力的化合物。然而，該類化合物體內(nèi)顯效形式和機(jī)制尚不明確。因此，闡明其體內(nèi)代謝及處置過(guò)程極為重要。本論文將評(píng)價(jià)葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（UGTs）在天然酚類化合物體內(nèi)處置中的作用，闡明代謝調(diào)控的作用機(jī)制，為明確該類物質(zhì)體內(nèi)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供科學(xué)依據(jù)。具體研究目標(biāo)如下：（1）測(cè)定兩種酚類化合物（辣椒素和補(bǔ)骨脂定）的UGT代謝活性；（2）評(píng)價(jià)外排轉(zhuǎn)運(yùn)體【如乳腺癌耐

2、藥蛋白（BCRP）和多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRPs）】在 UGT代謝物胞外轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用；（3）考察外排轉(zhuǎn)運(yùn)體對(duì) UGT代謝的調(diào)控效應(yīng)；（4）闡明外排轉(zhuǎn)運(yùn)體調(diào)控UGT代謝的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.采用酶孵育法，分別測(cè)定辣椒素和補(bǔ)骨脂定在微粒體以及各 UGT亞型酶中的代謝活性。并通過(guò)相關(guān)性分析及活性相關(guān)因子法（RAF），確定代謝辣椒素和補(bǔ)骨脂定的主要UGT亞型酶。
　　2.采用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，構(gòu)建UGT1A1酶高表達(dá)的

3、HeLa細(xì)胞株（簡(jiǎn)稱為HeLa1A1細(xì)胞）。使用化學(xué)抑制法（即BCRP抑制劑Ko143、MRPs抑制劑MK-571）及生物抑制法（shRNA介導(dǎo)的基因沉默），考察外排轉(zhuǎn)運(yùn)體在UGT代謝物外排中的作用。
　　3.采用慢病毒轉(zhuǎn)染 shRNA技術(shù)，構(gòu)建單一外排轉(zhuǎn)運(yùn)體（BCRP、MRP1、MRP3和MRP4）低表達(dá)的HeLa1A1細(xì)胞株（簡(jiǎn)稱為 HeLa1A1-BCRP-shRNA、HeLa1A1-MRP1-shRNA、HeLa1A1-M

4、RP3-shRNA和HeLa1A1-MRP4-shRNA）。測(cè)定三種酚類化合物（染料木素、芹菜素和大黃素）在上述細(xì)胞株中的總代謝程度——fmet，考察外排轉(zhuǎn)運(yùn)體對(duì)UGT代謝的調(diào)控效應(yīng)。
　　4.基于HeLa1A1和HeLa1A1-MRP4-shRNA細(xì)胞模型，以染料木素和芹菜素為模型化合物，測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)的代謝物外排速率及胞內(nèi)蓄積。構(gòu)建二室藥代動(dòng)力學(xué)模型，模型中引入U(xiǎn)GT代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)以及去葡萄糖醛酸化反應(yīng)等過(guò)程。將此模型與藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)

5、數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，評(píng)價(jià)去葡萄糖醛酸化反應(yīng)（即無(wú)效循環(huán)）在外排調(diào)控UGT代謝中的作用。
　　結(jié)果：
　　1.辣椒素和補(bǔ)骨脂定易被UGT酶代謝
　?。╝）辣椒素在人肝微粒體（HLM）中發(fā)生 UGT代謝，代謝辣椒素的亞型有UGT1A1、1A3、1A7、1A8、1A9、2B7、2B15和2B17。辣椒素代謝速率與UGT1A1蛋白水平以及β-雌二醇（UGT1A1特異性底物）代謝速率呈顯著性相關(guān)（P<0.05）。同時(shí)，辣椒素代謝速率與

6、 UGT2B7蛋白水平以及齊多夫定（UGT2B7特異性底物）代謝速率也具有顯著相關(guān)性（P<0.01）。此外，UGT1A1和2B7對(duì)辣椒素代謝的貢獻(xiàn)率分別為30.3％和49.0%。上述結(jié)果表明，UGT1A1和2B7是代謝辣椒素的主要亞型酶。
　?。╞）補(bǔ)骨脂定在HLM中發(fā)生UGT代謝，產(chǎn)生兩個(gè)代謝物（即9-O-G和3-O-G）。參與補(bǔ)骨脂定代謝的亞型酶有UGT1A1、1A7、1A8和1A9。其中，僅UGT1A9介導(dǎo)3-O-G的產(chǎn)生，

7、提示UGT1A9特異性催化補(bǔ)骨脂定（3-OH）的代謝，3-O-G可能為UGT1A9活性的標(biāo)記物。抑制HLM中UGT1A9的活性，能顯著抑制補(bǔ)骨脂定（3-OH）的代謝。補(bǔ)骨脂定（3-OH）代謝速率與UGT1A9蛋白水平及丙泊酚（UGT1A9特異性底物）代謝速率具有顯著相關(guān)性（p<0.001）。此外，UGT1A9在補(bǔ)骨脂定（3-OH）代謝中的貢獻(xiàn)率為99.6%。以上結(jié)果表明，補(bǔ)骨脂定（3-OH的代謝）可以作為UGT1A9的標(biāo)記性底物。

8、>　　2.外排轉(zhuǎn)運(yùn)體BCRP和MRPs在UGT代謝物外排中起重要作用
　　成功構(gòu)建了HeLa1A1細(xì)胞株。白楊素在該細(xì)胞株中能發(fā)生UGT代謝。抑制BCRP和MRPs的活性，能顯著降低代謝物外排速率和清除率（p<0.01）。降低單一外排轉(zhuǎn)運(yùn)體（BCRP、MRP1、MRP3和MRP4）的表達(dá)量，同樣導(dǎo)致代謝物外排速率和清除率顯著降低（p<0.01）。說(shuō)明，BCRP、MRP1、MRP3和MRP4介導(dǎo)UGT代謝物的外排。
　　3.外

9、排轉(zhuǎn)運(yùn)體對(duì)UGT代謝具有調(diào)控效應(yīng)
　　成功構(gòu)建了單一轉(zhuǎn)運(yùn)體低表達(dá)的HeLa1A1-BCRP-shRNA、HeLa1A1-MRP1-shRNA、HeLa1A1-MRP3-shRNA和HeLa1A1-MRP4-shRNA細(xì)胞株。對(duì)比HeLa1A1細(xì)胞，染料木素、芹菜素和大黃素在上述細(xì)胞株中的代謝程度以及代謝物外排速率均顯著下降（p<0.01）。此結(jié)果提示，外排轉(zhuǎn)運(yùn)體是影響UGT代謝的關(guān)鍵因素，BCRP、MRP1、MRP3和MRP4可以

10、調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的UGT代謝。
　　4.無(wú)效循環(huán)可能為外排轉(zhuǎn)運(yùn)體調(diào)控UGT代謝的主要作用機(jī)制
　　與 HeLa1A1細(xì)胞相比，染料木素和芹菜素在 HeLa1A1-MRP4-shRNA細(xì)胞中的總代謝程度和代謝物外排速率均顯著降低（P<0.01）。當(dāng)引入無(wú)效循環(huán)過(guò)程時(shí)，模型與藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合度高。擬合結(jié)果提示，無(wú)效循環(huán)為外排轉(zhuǎn)運(yùn)體調(diào)控UGT代謝的作用機(jī)制。
　　結(jié)論：
　　1.辣椒素和補(bǔ)骨脂定易被UGT酶代謝。主要負(fù)責(zé)辣