基于核酸適配體的β-葡萄糖醛酸苷酶一步純化固定化研究及其應用.pdf_第1頁
已閱讀1頁,還剩91頁未讀, 繼續(xù)免費閱讀

下載本文檔

版權說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內容提供方,若內容存在侵權,請進行舉報或認領

文檔簡介

1、隨著全球工業(yè)化進程的快速發(fā)展,能源和環(huán)境危機已成為全人類共同面對的難題。在工業(yè)生產過程中,這一問題尤為突出,尋找合理的解決之路已然迫在眉睫。而由生物催化主導的生產過程為此打開了一扇新的大門,生物催化法利用酶作為催化劑表現(xiàn)出良好的選擇性、專一性、高效性和綠色性,使用生物催化法代替?zhèn)鹘y(tǒng)的化學催化法突顯出更大的應用前景。但由于游離酶自身的一些缺陷限制了酶的工業(yè)化應用,而固定化酶可以很好地解決這些弊端。傳統(tǒng)的酶固定化方法存在諸多缺點,為適應生物

2、催化的規(guī)?;茝V及更好的滿足工業(yè)需求,迫切需要開發(fā)新型的酶固定化技術。
  核酸適配體是一類能夠對靶分子產生特異性相互作用的核酸單鏈,被廣泛應用于分子捕獲、生物成像、生物檢測、臨床診斷、藥物載送等領域。核酸適配體的高親和力和特異性使其在酶的固定化方面具有廣闊的開發(fā)潛力。本論文以開發(fā)新型酶固定化技術為目的,以甘草酸的生物催化轉化為應用平臺,通過改進的SELEX技術篩選β-葡萄糖醛酸苷酶(PGUS-E)的核酸適配體,并將其共價連接在氧

3、化石墨烯和磁珠上,用于 PGUS-E的一步純化固定化,進而生產高附加值甘草酸衍生物。主要研究內容及結果如下:
  (1)β-葡萄糖醛酸苷酶核酸適配體的篩選及表征
  通過鎳離子親和層析、離子交換、分子篩等方法對β-葡萄糖醛酸苷酶進行純化,并將其負載到 Ni-NTA磁珠上作為靶分子進行 SELEX篩選。以包含40 nt隨機序列的 ssDNA作為初始文庫,通過孵育、分離、擴增、制備 ssDNA完成一個篩選循環(huán)。同時為提高篩選特異

4、性,每三輪進行一次反向篩選過程。調整磁珠用量、孵育時間、洗滌次數(shù)等參數(shù)提高篩選效率。鑒于催化反應溫度的要求,將孵育溫度提高到40℃又進行了6輪篩選。篩選結束后經過克隆、測序總共得到16條 ssDNA序列。用表面等離子體共振技術測定其與 PGUS-E的親和力,結果表明篩選得到的 aptamer的解離常數(shù)在納摩爾級別,并且對 PGUS-E酶活沒有抑制作用。
 ?。?)Aptamer與載體的共價連接及表征
  選用比表面積極大、水

5、溶性極好的氧化石墨烯作為載體材料,通過化學改性提高其羧基官能團富含量。將氨基修飾的 aptamer通過酰胺反應共價連接到氧化石墨烯上,并用 UV-可見吸收光譜、熒光顯微鏡、FTIR等對其進行表征;用同樣的方法將 aptamer共價連接的羧基功能化的二氧化硅磁珠上,并進行相關表征。結果發(fā)現(xiàn),改性的氧化石墨烯對 Apt5和 Apt9的負載量分別為29.08μg/mg和35.03μg/mg;羧基磁珠對 Apt5和 Apt9的負載量分別為10.

6、685μg/mg和13.565μg/mg。
  (3)Aptamer與 PGUS-E之間的相互作用
  考察了離子強度和 pH值對 aptamer與 PGUS-E之間相互作用的影響。以 NaCl濃度控制離子強度大小,發(fā)現(xiàn)當 NaCl濃度大于0.3 M時可以破壞 aptamer與PGUS-E之間的相互作用;NaCl濃度為1 M時可以實現(xiàn) aptamer連接的磁珠的再生。pH變化對二者相互作用的影響很小,敏感程度遠不及離子強度。

7、pH為4和7時對二者相互作用有輕微影響。對 aptamer與 PGUS-E的吸附行為進行擬合,發(fā)現(xiàn)可以用 Tenkin等溫吸附模型、準二級動力學模型、Elovich動力學模型和Webber-Morris內擴散動力學模型對這一過程進行描述和預測。
  (4)β-葡萄糖醛酸苷酶核酸適配體的應用
  將篩選得到的 aptamer用于β-葡萄糖醛酸苷酶的一步純化固定化,并將固定化酶用于甘草酸的催化轉化過程,結果發(fā)現(xiàn) aptamer連

8、接的磁珠對 PGUS-E的最大負載量約為32μg/mg,經過7個反應批次后 Apt5和 Apt9固定化的 PGUS-E對甘草酸的轉化率分別為74.1%和56%,7個再生循環(huán)之后對甘草酸的轉化率分別是62.7%和58%;利用 aptamer自行構建了可以用于現(xiàn) PGUS-E微量檢測的方法,該方法檢測限低,操作簡單,靈敏度高,檢測速度很快;構建了利用 aptamer對 PGUS-E進行分離純化的方法,與傳統(tǒng)的鎳離子親和層析相比得到的 PGU

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經權益所有人同意不得將文件中的內容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內容負責。
  • 6. 下載文件中如有侵權或不適當內容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

評論

0/150

提交評論