阿魏酸鈉對(duì)大鼠脂肪干細(xì)胞促進(jìn)肝星狀細(xì)胞凋亡的增強(qiáng)作用及機(jī)制的初步研究.pdf

1、目的：促進(jìn)活化狀態(tài)的肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSCs）凋亡是目前治療肝纖維化的重要研究方向。脂肪干細(xì)胞（adipose-derived stem cells， ADSCs）能促進(jìn)共培養(yǎng)時(shí)HSCs的凋亡，以此為基礎(chǔ)探索阿魏酸鈉（sodium ferulate，SF）與 ADSCs共同作用是否能增強(qiáng)這種促凋亡作用，并探討其可能的作用機(jī)制。為阿魏酸鈉聯(lián)合脂肪干細(xì)胞移植治療肝纖維化的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法：

2、1、ADSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定：取 SD大鼠腹股溝區(qū)脂肪，膠原酶消化法獲得原代ADSCs，傳代純化后，取第三代細(xì)胞用于細(xì)胞表面標(biāo)志物鑒定，流式細(xì)胞儀檢測 CD29、CD44、CD45、CD90表達(dá)情況。2、購買肝星狀細(xì)胞株HSC-T6，免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測活化標(biāo)志物α-SMA的表達(dá)。3、阿魏酸鈉、ADSCs和 HSCs的共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)：利用Transwell共培養(yǎng)體系對(duì)ADSCs和HSCs進(jìn)行共培養(yǎng)。共分為4組，每組5孔：A組，ADSCs與

3、HSCs共培養(yǎng)；B組，ADSCs與HSCs共培養(yǎng)，同時(shí)加入500μg/mL阿魏酸鈉；C組，HSCs單獨(dú)培養(yǎng)，加入500μg/mL阿魏酸鈉；D組，對(duì)照組，單獨(dú)培養(yǎng)HSCs。48h后，收集各孔HSCs，行Annexin-V PI染色，流式細(xì)胞儀檢測并比較各組 HSCs凋亡率。4、阿魏酸鈉預(yù)處理ADSCs后的共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)：用SF預(yù)處理ADSCs48h，然后與HSCs共培養(yǎng)作為實(shí)驗(yàn)組；未經(jīng)處理的 ADSCs與 HSCs共培養(yǎng)作為對(duì)照組。48h后行

4、Annexin-V PI染色，流式細(xì)胞儀檢測并比較兩組HSCs凋亡率。5、阿魏酸處理對(duì)ADSCs性狀的影響：500μg/m阿魏酸鈉處理ADSCs48h，從細(xì)胞形態(tài)、生長曲線、表面標(biāo)志物三個(gè)方面分析ADSCs性狀是否發(fā)生改變。6、阿魏酸鈉處理對(duì) ADSCs培養(yǎng)上清中肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）和神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）分泌量的影響：用不同濃度的阿魏酸鈉（0

5、μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL、1500μg/mL）處理ADSCs，48h后收集培養(yǎng)上清。ELISA試劑盒檢測上清中HGF和NGF的濃度。7、阿魏酸鈉對(duì)ADSCs的HGFmRNA和 NGFmRNA表達(dá)的影響：不同濃度的阿魏酸鈉（0μg/mL、100μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL、）處理ADSCs，培養(yǎng)48h，提取各組細(xì)胞總RNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測各組HGFmRN

6、A、NGFmRNA表達(dá)情況。結(jié)果：1、從大鼠體內(nèi)成功分離出 ADSCs。第三代細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)情況符合ADSCs表面標(biāo)志物表達(dá)情況。2、HSC-T6細(xì)胞復(fù)蘇后生長良好，免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果提示所培養(yǎng) HSC-T6處于活化狀態(tài)。3、SF加入共培養(yǎng)體系48h后，各組HSCs凋亡率為：A、B、C三組凋亡率均高于D組（P<0.05或P<0.01），B組凋亡率高于A、C、D各組（P<0.05或P<0.01）。4、用阿魏酸鈉預(yù)處理48h后的ADSCs

7、與HSCs共培養(yǎng)，阿魏酸預(yù)處理組HSCs凋亡率高于對(duì)照組（P<0.01）。5、經(jīng)500μg/mL阿魏酸鈉處理48h后ADSCs在形態(tài)、生長曲線和表面標(biāo)志物方面與未經(jīng)處理的ADSCs相似。6、阿魏酸鈉對(duì)ADSCs上清中HGF和NGF分泌量的影響：除50μg/mL組與對(duì)照組的NGF濃度無明顯差異外（P>0.05），其余各濃度組與對(duì)照組相比HGF、NGF均有不同程度的升高（P<0.05或 P<0.01），且在一定濃度范圍內(nèi)隨阿魏酸鈉濃度的增加

8、而升高。7、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測阿魏酸鈉對(duì)ADSCs中HGFmRNA、NGFmRNA表達(dá)的影響，結(jié)果顯示：100μg/mL組HGFmRNA與對(duì)照組相比差異不明顯（P＞0.05），500μg/mL、1000μg/mL組與對(duì)照組比較均有升高（P<0.01）；而三個(gè)濃度組的NGFmRNA與對(duì)照組相比均有不同程度的上升（P<0.05或P<0.01）。
　　結(jié)論：1．阿魏酸鈉預(yù)處理能增強(qiáng)ADSCs對(duì)HSCs的凋亡促進(jìn)作用。2．阿魏酸鈉能增