移植脂肪的成活及干細胞對其促進作用的研究.pdf

1、自體脂肪移植在臨床有著很好的應(yīng)用前景，常用來修復軟組織缺損，可應(yīng)用于半側(cè)顏面萎縮、隆胸、面部年輕化、鼻唇溝填充、隆顳、隆鼻、隆唇、隆頦等。自體脂肪移植有許多優(yōu)點，比如來源充足、取材簡單、相對便宜、無免疫排斥反應(yīng)，以及沒有假體和異基因填充材料的副反應(yīng)及潛在風險等。但是，脂肪移植術(shù)后的低成活率及多種并發(fā)癥一直困擾著臨床醫(yī)生，如鈣化、壞死、硬化結(jié)節(jié)和液化囊腫等，成為制約自體脂肪移植臨床廣泛開展的瓶頸。關(guān)于移植脂肪的吸收率，不同文獻中報道不一，

2、從20％-90％不等，如何提高移植脂肪組織的成活率及成活質(zhì)量，是目前國內(nèi)外脂肪移植研究的關(guān)鍵性問題。而關(guān)于脂肪移植后移植脂肪組織的轉(zhuǎn)歸，及血運重建的方式這些基本問題尚未明確，因為缺乏移植脂肪成活的最直接證據(jù)，目前國際上還存在較大爭議，大致有三種學說：宿主替代學說、脂肪細胞成活學說、ASCs替代學說，這些問題值得深入探討和明確。目前認為，干細胞治療在脂肪移植中可以起重要的作用，尤其是脂肪來源干細胞（adipose-derived stem

3、/stromal cells, ASCs）及基質(zhì)血管成分（stromal vascular fraction, SVF），被多個研究小組證實能夠有效促進移植脂肪成活，而其他的干細胞如骨髓間充質(zhì)干細胞（ bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMSCs）是否也有相同的作用，目前仍未見報道。對于臨床應(yīng)用來說，干細胞如果不用體外擴增培養(yǎng)，直接分離后即與脂肪混合應(yīng)用更容易操作，可行性強，但是AS

4、Cs和BMSCs的直接分離得到的細胞與培養(yǎng)后的細胞治療效果是否存在差異也值得進一步的探討。為解決這些問題，進行了以下的研究，這些研究將為臨床脂肪移植的干細胞治療提供依據(jù)。
　　實驗一C57BL/6-gfp和C57BL/6小鼠脂肪互換移植
　　目的：
　　證實移植脂肪是否可以在受區(qū)部分成活，明確其供應(yīng)血管的來源。
　　方法：
　　手術(shù)切取C57BL/6-gfp（GFP）小鼠和C57BL/6（B6）小鼠腹股溝脂

5、肪，剪碎制備成脂肪顆粒，注射到配對的小鼠背部，每只小鼠沿背部脊柱兩側(cè)共有兩個注射位點，0.2ml/點（0.195g/點）。術(shù)后3d，7d，2w，4w，2m，3m，4m時取材稱重、固定行 HE染色觀察移植脂肪成熟及改建情況，4m時行CD34免疫組化觀察血管新生情況，并計算新生血管密度，行α-SMA組化染色觀察血管來源。
　　結(jié)果：
　　4月時GFP和B6小鼠背部移植脂肪成活量分別為52.3％，50.08％，每個時間點取材移植脂

6、肪成活量之間比較無統(tǒng)計學差異。組織學評價顯示，不同時間點移植脂肪組織由炎癥、血管新生、組織改建到結(jié)構(gòu)成熟的生理過程。CD34免疫組化染色顯示GFP和B6小鼠的移植脂肪血管密度分別為31.3±3.9個/mm2，29.6±3.2個/mm2，二者沒有統(tǒng)計學差異。α-SMA染色顯示4月時來源于GFP的脂肪移植后有紅色的血管長出來，而B6小鼠的脂肪移植后也有紅色的血管長出來，但熒光顯微鏡下卻不顯示綠色。
　　結(jié)論：
　　脂肪移植是可行

7、的，移植的脂肪能夠部分成活，新生血管來源于受區(qū)，如果移植脂肪吸收的問題能得到解決，脂肪移植應(yīng)用將更廣泛。
　　實驗二比較人與家兔ASCs體外培養(yǎng)特性
　　目的：
　　探討在相同培養(yǎng)條件下，人與家兔ASCs體外培養(yǎng)特性的異同。
　　方法：
　　體外分離人腹部取皮植皮術(shù)來源的ASCs（human ASCs, hASCs）、家兔背部皮下脂肪來源的ASCs（rabbit ASCs, rASCs），體外培養(yǎng)并傳代，觀

8、察各自生長形態(tài)，取第3代ASCs比較二者生長及增殖能力、表面CD分子鑒定、成脂和成骨分化能力。
　　結(jié)果：
　　人和家兔的皮下脂肪均能在體外分離出貼壁生長呈長梭形的細胞；按生長融合達90％以上為傳代標準，hASCs一般6-8天可傳代，rASCs則需要4-5天傳代；MTT結(jié)果顯示 rASCs在第4天達到生長高峰，而hASCs則在第6天達到生長高峰；表面標記分子流式鑒定均顯示 CD29＋CD31－；在同樣的誘導條件下，hASCs

9、能誘導成脂成骨，而rASCs能更快誘導成脂，但成骨誘導結(jié)果較差。
　　結(jié)論：
　　體外分離培養(yǎng)的hASCs和rASCs均具有干細胞的培養(yǎng)特性；與hASCs相比，rASCs具有更強的生長增殖和誘導成脂能力，但誘導成骨能力較差，家兔是做脂肪移植研究實驗動物不錯的選擇。
　　實驗三 ASCs和BMSCs促進移植脂肪成活的對比研究
　　目的：
　　比較ASCs、SVF、BMSCs和BM對移植脂肪成活的促進作用。

10、r>　　方法：
　　用手術(shù)方法切取家兔腹股溝脂肪，手術(shù)抽取脛骨骨髓，分別進行ASCs和BMSCs體外分離培養(yǎng)、大量擴增；取第3代ASCs，BMSCs分別進行成脂、成骨誘導和流式鑒定；制備SVF和全骨髓，進行流式鑒定；脂肪移植裸鼠實驗分為5組：ASCs、SVF、BMSCs、BM和空白對照DMEM/F12組，每組4只裸鼠，沿背部脊柱兩側(cè)各兩點，每組共16個注射移植位點，每點0.3mlAG+0.2ml細胞成分；術(shù)后4m時取材稱重、固定行

11、HE染色觀察移植脂肪組織結(jié)構(gòu)，行CD31免疫組化染色觀察新生血管及其密度。
　　結(jié)果：
　　家兔ASCs和BMSCs體外分離培養(yǎng)成功，為貼壁生長，第3代細胞形態(tài)均呈長梭形。二者成脂誘導實驗均能形成大量脂滴，成骨誘導實驗均能形成鈣鹽沉積。流式鑒定顯示ASCs組CD29：96.2％，CD31：3.8％；SVF組CD29：17.0％，CD31：1.3％；BMSCs組CD29：45.0％，CD31：1.6％；BM組CD29：24.6

12、％，CD31：1.8％。ASCs、SVF、BMSCs、BM和空白對照組各組移植脂肪成活量分別為0.1798±0.0033g，0.2096±0.0024g，0.1761±0.0014g，0.2052±0.0015g，0.1350±0.0020g，組間差異均有統(tǒng)計學意義。HE染色顯示SVF組和BM組移植脂肪成活較好，組織結(jié)構(gòu)完整，脂滴大小均一，可見脂肪組織中間有豐富的血管存在；ASCs組和BMSCs組移植脂肪成活尚可，組織結(jié)構(gòu)尚完整，脂滴大

13、小一般均一，可見脂肪組織中有結(jié)締組織纖維間隔和新生血管形成；空白對照組結(jié)締組織纖維間隔明顯增多，脂滴大小不一，有少量較大空泡形成。各組移植的脂肪血管密度分別29.3±1.6條/mm2，32.6±2.1條/mm2，27.2±1.3條/mm2，30.4±1.5條/mm2，23.3±1.9條/mm2，兩兩之間比較有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)論：
　?。?）體外分離培養(yǎng)的ASCs與BMSCs均為間充質(zhì)干細胞，具備干細胞表面標記和多向分化能