線蟲線粒體極長鏈脂酰CoA脫氫酶、烯脂酰fCoA水合酶和硫解酶的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究.pdf

1、線粒體脂肪酸β氧化包括四步催化反應(yīng)過程,通過這四步反應(yīng)過程脂酰CoA的脂肪酸鏈被逐漸降解掉兩個(gè)碳原子。參與這四步催化反應(yīng)的酶類依次包括脂酰CoA脫氫酶、烯脂酰CoA水合酶、L-3-羥脂酰CoA脫氫酶以及硫解酶,這四步反應(yīng)過程是:在線粒體脂肪酸β氧化第一步反應(yīng)中,脂酰CoA脫氫酶催化脂酰CoA脂肪酸碳鏈α和β位之間的脫氫酶反應(yīng),生成反式-2,3-烯脂酰CoA；然后烯脂酰CoA水合酶催化反式-2,3-烯脂酰CoA的α和β位之間的水合反應(yīng)生成

2、L-3-羥脂酰CoA；在第三步反應(yīng)中,L-3-羥脂酰CoA脫氫酶催化L-3-羥脂酰CoA的α和β位之間的再次脫氫反應(yīng),生成3-酮脂酰CoA；最后硫解酶將3-酮脂酰CoA降解成一個(gè)乙酰CoA分子和一個(gè)縮短兩個(gè)碳原子的脂酰CoA?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)許多代謝性疾病與線粒體脂肪酸β氧化缺陷相關(guān),例如代謝性酸中毒、高氨血癥、脂肪肝以及糖尿病等。最近有關(guān)β氧化機(jī)制和缺陷治療的研究越來越受到人們的重視,線蟲是人類代謝疾病研究的一種良好的動(dòng)物模型,但有關(guān)其線粒體

3、β氧化的結(jié)構(gòu)與功能的報(bào)道卻很少。作者克隆表達(dá)了三種與線蟲脂肪酸代謝相關(guān)的基因,這些基因分別是Y45F3A.3,C32E8.9和F53A2.7,根據(jù)WormBase數(shù)據(jù)庫的信息,它們的表達(dá)產(chǎn)物分別為線蟲極長鏈脂酰CoA脫氫酶、烯脂酰CoA水合酶以及硫解酶。作者將這三種基因克隆到原核表達(dá)載體上,在大腸桿菌中大量表達(dá),并分別純化得到了高純度的蛋白質(zhì)樣品。然后通過晶體生長條件的優(yōu)化得到了高質(zhì)量的蛋白晶體,利用日本光子工廠的BL5A線站和BL17

4、A線站分別收集了這三種蛋白質(zhì)晶體的高分辨率衍射數(shù)據(jù),最終解析了線蟲線粒體極長鏈脂酰CoA脫氫酶結(jié)合底物C11-CoA的晶體結(jié)構(gòu)、線蟲線粒體烯脂酰CoA水合酶的晶體結(jié)構(gòu)和線蟲線粒體硫解酶及其結(jié)合底物CoA的晶體結(jié)構(gòu)。
　　 線蟲極長鏈脂酰CoA脫氫酶的三維結(jié)構(gòu)和靜態(tài)光散射實(shí)驗(yàn)證明了該脂酰CoA脫氫酶具有獨(dú)特的四聚體聚合狀態(tài),而現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)的其他極長鏈CoA脫氫酶都不具有這一聚合狀態(tài),并且體外測活實(shí)驗(yàn)說明了線蟲極長鏈脂酰CoA脫氫酶的四

5、聚體結(jié)構(gòu)正是其催化底物脫氫反應(yīng)的活性狀態(tài)。線蟲極長鏈脂酰CoA脫氫酶結(jié)合底物C11-CoA的晶體結(jié)構(gòu)以及體外測活的實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示了該脂酰CoA脫氫酶可改變底物結(jié)合位點(diǎn)的構(gòu)象進(jìn)而擴(kuò)大底物結(jié)合口袋的空間以容納具有更長脂肪酸碳鏈的底物。線蟲烯脂酰CoA水合酶晶體的空間群為P21,晶胞參數(shù)為α=138.6,b=116.7,c=115.3(A),α=β=90.0,γ=124.0°。通過對于線蟲烯脂酰CoA水合酶晶體衍射數(shù)據(jù)的分析,作者推測該晶體并非

6、普通的“孿晶”而是由三套空間群均為P21的晶格系統(tǒng)組成的“三晶”。根據(jù)這一假設(shè)并借鑒“去孿”程序的原理,作者通過自行編寫“去三晶”程序最終解析了該線蟲烯脂酰CoA水合酶的晶體結(jié)構(gòu)。靜態(tài)光散射實(shí)驗(yàn)證明該線蟲烯脂酰CoA水合酶具有不同于其他烯脂酰CoA水合酶的三聚體結(jié)構(gòu)。線蟲硫解酶是由分子量為43 kDa單體組成的同源四聚體結(jié)構(gòu),結(jié)構(gòu)分析表明線蟲硫解酶為合成硫解酶,對其野生型及其突變體的體外測活實(shí)驗(yàn)說明線蟲硫解酶的四聚體結(jié)構(gòu)是其催化乙酰乙酰