油茶β-酮脂酰-COA合酶基因的全長(zhǎng)CDNA克隆.pdf

1、油茶(Camellia oleifera)是我國(guó)重要的木本油料樹(shù)種,與油棕、油橄欖和椰子并稱(chēng)為世界四大木本食用油料樹(shù)種。超長(zhǎng)鏈脂肪酸為生物體中碳原子數(shù)超過(guò)18碳的脂肪酸。這類(lèi)脂肪酸在生物體中具有廣泛的生理功能,它們參與種子甘油酯、生物膜膜脂及鞘脂的合成,并為角質(zhì)層蠟質(zhì)的生物合成提供前體物質(zhì)。角質(zhì)層是植物自我防護(hù)的最后一道屏障,在植物生長(zhǎng)發(fā)育、適應(yīng)外界環(huán)境作用方面中起重要作用。β-酮脂酰-CoA合酶是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中催化超長(zhǎng)鏈脂肪酸合成的第一步

2、縮合反應(yīng)的限速酶,β-酮脂酰-CoA合酶基因(KCS)的克隆對(duì)定向調(diào)控油料作物的油脂成分、提供有益脂肪酸具有重要的作用。本論文主要研究結(jié)果如下:
　　 1.油茶β-酮脂酰-CoA合酶基因的鑒定。在本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的油茶cDNA文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)一條β-酮脂酰-CoA合酶基因,經(jīng)過(guò)測(cè)序拼接其長(zhǎng)度為1147bp,并且含有一個(gè)polyA尾巴。將此cDNA序列經(jīng)過(guò)在線翻譯并同其它物種的同類(lèi)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn),此cDNA克隆從其第51bp的位置

3、至779bp處屬于編碼區(qū),除去前51個(gè)堿基載體序列,發(fā)現(xiàn)此cDNA與其它物種的同種蛋白質(zhì)的相比5’端缺失了約290個(gè)氨基酸殘基及非編碼區(qū)的cDNA序列,3’端是完整的。
　　 2.油茶β-酮脂酰-CoA合酶基因的全長(zhǎng)cDNA克隆。根據(jù)已知的油茶β-酮脂酰-CoA合酶基因的 EST序列,用專(zhuān)業(yè)軟件Primer Premier5.0設(shè)計(jì)了油茶β-酮脂酰-CoA合酶基因的特異引物GSP1、GSP2及GSP,采用5'RACE技術(shù),以油茶

4、‘湘林1號(hào)’種子為材料提取RNA,并擴(kuò)增出一條約1300bp的cDNA片段。將該片段連接、轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α菌株中,經(jīng)過(guò)測(cè)序得到該片段的cDNA序列。通過(guò)Vector NTI9.0等生物軟件的分析,將該序列與原來(lái)的 EST序列進(jìn)行拼接,獲得了一條長(zhǎng)為1575bp的序列。根據(jù)拼接得到的序列,設(shè)計(jì)了一對(duì)引物F1和R1,其中F1位于油茶β-酮脂酰-CoA合酶基因的5’端起始密碼子處,R2位于3'端終止密碼子處,用RT-PCR產(chǎn)物作為模板,

5、經(jīng)擴(kuò)增得到的片段大小與理論上大小一致,并將拼接后的片段回收、克隆、轉(zhuǎn)化及測(cè)序。由此得到的測(cè)序結(jié)果與拼接的全長(zhǎng)cDNA序列完全一致,從而獲得了油茶油條β-酮脂酰-CoA合酶基因的全長(zhǎng)cDNA序列。
　　 3.油茶β-酮脂酰-CoA合酶基因的功能預(yù)測(cè)。通過(guò)生物信息學(xué)軟件Vector NTI9.0對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),此cDNA長(zhǎng)1891bp,含有一個(gè)長(zhǎng)1575bp的ORF,起始密碼子為ATG,終止密碼子為 TAG,編碼525個(gè)氨基

6、酸殘基,還包括5’非編碼區(qū)45bp和3’非編碼區(qū)268bp及一個(gè)長(zhǎng)50bp的polyA尾巴。經(jīng)過(guò)在GenBank上的序列比對(duì)獲知此序列與其它物種的油茶β-酮脂酰-CoA合酶基因的相似性達(dá)到85％,由此確認(rèn)此序列是油茶的β-酮脂酰-CoA合酶基因的全長(zhǎng)cDNA序列。根據(jù)此cDNA序列推導(dǎo)的蛋白質(zhì)序列,應(yīng)用生物信息學(xué)軟件 Antheprot5.0對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)、等電點(diǎn)、分子量、跨膜結(jié)構(gòu)、信號(hào)肽等進(jìn)行功能預(yù)測(cè)分析,結(jié)果顯示此蛋白的等電點(diǎn)pI為9

7、.475,分子量為58173.716Da,共有四個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域,其中59～73,97～110兩個(gè)位置與其它物種的油茶β-酮脂酰-CoA合酶基因跨膜結(jié)構(gòu)相吻合,254～261,387～389存在跨膜結(jié)構(gòu)的可能性較小。應(yīng)用 Vector NTI9.0軟件將油茶的油茶β-酮脂酰-CoA合酶基因與其它物種的同類(lèi)蛋白質(zhì)進(jìn)行親緣關(guān)系的分析,不同物種在遺傳進(jìn)化上主要有兩個(gè)分支。其中,白菜型冬油菜、芥菜、甘藍(lán)、甘藍(lán)型油菜、海甘藍(lán)等屬于一類(lèi),而油茶、大麥、