微擬球藻脂酰輔酶A合成酶與脂肪酸延伸酶的研究.pdf

1、隨著石油資源的日益枯竭與能源需求量日益增長(zhǎng)這一矛盾的突出,可再生能源的開發(fā)及利用受到世界各地的關(guān)注。人們迫切尋找一種能夠代替化石燃料的可再生資源。然而,原料問題一直是制約生物柴油發(fā)展的“瓶頸”。曾經(jīng),人們寄希望于傳統(tǒng)的油料作物、糧食、動(dòng)植物油脂、農(nóng)林廢棄物等,但是這些都有各種各樣的缺點(diǎn)。微藻可以生長(zhǎng)在海洋、河流以及湖泊里,不用占用耕地。它們能十分有效地利用太陽能進(jìn)行光合自養(yǎng),富集油脂。微藻還具有生長(zhǎng)周期短,可以大規(guī)模培養(yǎng)的特點(diǎn),被認(rèn)為是

2、制備生物柴油的優(yōu)良材料。
　　 超長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸(VLCPUFAs)尤其是EPA(eicosapentaenoic acid)和DHA(docosapentaenoic acid)對(duì)人體及動(dòng)植物細(xì)胞都是極為重要的,對(duì)某些疾病起到明顯的預(yù)防和治療作用。但是人類自身只能合成少量的EPA和DHA,遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足自身需要。因此需要攝入一定量的VLCPUFAs以補(bǔ)充人體自身合成的不足。目前,VLCPUFAs的主要來源是深海魚油,但是由于

3、海洋可捕撈魚類資源的日益減少和市場(chǎng)需求的迅速增長(zhǎng),該途徑已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足需要,尋找更為持續(xù)、穩(wěn)定的VLCPUFAs來源已經(jīng)成為當(dāng)務(wù)之急。許多種類的海洋微藻能夠從頭合成VLCPUFAs且含量較高,脂肪酸組成穩(wěn)定,沒有難聞的魚腥味等優(yōu)點(diǎn)正逐漸成為魚油的良好替代資源,具有巨大的開發(fā)潛力。
　　 微擬球藻(Nannochloropsis oculata),屬于真眼點(diǎn)藻綱(Eustigmatophyceae),微擬球藻屬(Nannochl

4、oropsis)。該藻富含EPA,因而被認(rèn)為有望成為EPA產(chǎn)品生產(chǎn)的生物資源。此外,該藻油脂含量非常高,達(dá)到干重的30％以上。很多微藻在獲得高油脂含量的同時(shí)卻造成了生物量減少的現(xiàn)象。目前的研究表明,微擬球藻生物量的積累與油脂含量之間呈現(xiàn)最優(yōu)的組合,被認(rèn)為是最適于開發(fā)的能源微藻之一?？傊?微擬球藻是一類非常重要的應(yīng)用性經(jīng)濟(jì)微藻,但是其分子信息比較匱乏,需要進(jìn)行深入研究。本實(shí)驗(yàn)以微擬球藻為研究對(duì)象,分別對(duì)其油脂代謝中的脂酰輔酶A合成酶(AC

5、S)和EPA合成中的延伸酶(Elongase)進(jìn)行了研究。
　　 本研究從微擬球藻中克隆得到一個(gè)長(zhǎng)鏈脂酰輔酶A合成酶(LACS)基因的cDNA全長(zhǎng),并命名為NOLACS。NOLACS的ORF為1947bp,預(yù)測(cè)編碼648個(gè)氨基酸殘基,蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為71kDa。NCBI中進(jìn)行BlastX比對(duì)發(fā)現(xiàn),NOLACS基因編碼的蛋白質(zhì)與三角褐指藻、假微型海鏈藻等的LACS高度相似。根據(jù)NOLACS編碼的長(zhǎng)鏈脂酰輔酶A合成酶能夠互補(bǔ)LAC

6、S缺陷型釀酒酵母YB525生長(zhǎng)設(shè)計(jì)酵母互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其功能,并分析了該酶的底物偏好性。結(jié)果顯示,NOLACS能夠活化飽和脂肪酸和部分不飽和脂肪酸,尤其偏好于長(zhǎng)鏈脂肪酸。另外,進(jìn)一步研究了限氮處理對(duì)微擬球藻中總脂含量以及NOLACS基因轉(zhuǎn)錄水平的影響,并探討總脂含量與NOLACS基因轉(zhuǎn)錄水平的關(guān)系。
　　 運(yùn)用RACE方法克隆得到了一個(gè)延伸酶的cDNA全長(zhǎng)序列,其ORF為522個(gè)堿基,預(yù)測(cè)編碼173個(gè)氨基酸殘基。比對(duì)結(jié)果顯示,該序列