老鼠簕生物堿A對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)肝纖維化大鼠細(xì)胞外基質(zhì)及相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的影響.pdf

1、目的:本課題組已成功合成并鑒定了老鼠簕生物堿A（HBOA，即4-羥基-苯并惡唑-2-酮），在前期研究基礎(chǔ)上，本研究從細(xì)胞外基質(zhì)以及相關(guān)細(xì)胞因子方面探討HBOA對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠的治療作用，并探討其作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)以及臨床上均證明，肝纖維化具有可逆性。因此，尋找既安全又有效的藥物來逆轉(zhuǎn)肝纖維化，在肝臟疾病領(lǐng)域非常具有研究?jī)r(jià)值。
　　方法:將雄性SD（Sprague Dawley）大鼠隨機(jī)分為：（1）正常對(duì)照組，灌胃2 mL/

2、kg生理鹽水。（2）肝纖維化模型組，灌胃50％CCl4油溶液2 mL/kg，誘導(dǎo)化學(xué)性肝纖維化模型。連續(xù)造模8周，經(jīng)病理結(jié)果證實(shí)肝纖維化造模成功后，將肝纖維化大鼠隨機(jī)分為：模型對(duì)照組、陽性對(duì)照組（秋水仙堿）、HBOA高劑量組、HBOA低劑量組。從第9周開始，給藥干預(yù)，連續(xù)4周，每天一次。陽性對(duì)照組灌胃秋水仙堿混懸液0.4 mg/kg；HBOA高劑量組灌胃老鼠簕生物堿A溶液100 mg/kg，HBOA低劑量組則灌胃50 mg/kg老鼠簕生

3、物堿A溶液；此外，正常對(duì)照組和肝纖維化模型對(duì)照組灌胃10 mL/kg的0.6% CMC-Na溶液。為預(yù)防大鼠肝纖維化自動(dòng)逆轉(zhuǎn)，給藥干預(yù)期間，除正常對(duì)照組灌胃相應(yīng)體積生理鹽水外，其余各組大鼠繼續(xù)給予灌胃50% CCl4溶液每周2次。末次給藥24小時(shí)后，對(duì)已禁食12h后的大鼠麻醉后采集腹主動(dòng)脈血。分離上層血清，并取部分上層血清用于全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清谷丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）的活性；用酶聯(lián)免疫吸附法（EL

4、ISA法）檢測(cè)大鼠血清中透明質(zhì)酸（HA）、粘連蛋白（LN）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）的含量。大鼠頸椎脫臼處死，采集肝組織、稱重并計(jì)算肝指數(shù)；制作肝組織病理學(xué)切片，光鏡下觀察HE染色、Masson三色染色肝臟組織病理，計(jì)算肝纖維化評(píng)分；免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肝組織I型膠原蛋白（COL-I）、III型膠原蛋白（COL-III）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）的

5、蛋白表達(dá)；RT-PCR法檢測(cè)大鼠肝組織COL-I、COL-III、TNF-α、TGF-β1、過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（PPARγ）、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK1/2）的基因表達(dá)。
　　結(jié)果:血清生化指標(biāo)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組血清ALT、AST的活性有明顯升高（P<0.05）；與模型對(duì)照組比較，HBOA-H組、HBOA-L組血清ALTA、AST的活性均有顯著降低（P<0.01或P<0.05）。與正常對(duì)照組比

6、較，模型對(duì)照組血清HA、LN含量明顯增多（P<0.01）；與模型對(duì)照組比較，HBOA-H組、HBOA-L組血清HA、LN含量均有顯著減少（P<0.01或P<0.05）。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組血清TNF-α、TGF-β1含量明顯升高(P<0.01);與模型對(duì)照組比較，HBOA-H組、HBOA-L組能顯著降低大鼠血清中TNF-α、TGF-β1的含量（P＜0.05或P＜0.01）。
　　病理結(jié)果顯示，HBOA能明顯降低CCl4誘導(dǎo)

7、的大鼠肝組織纖維化程度。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組的肝臟指數(shù)增大明顯（P＜0.01）；與模型對(duì)照組比較，HBOA-H組、HBOA-L組的肝臟指數(shù)明顯降低（P<0.05或P<0.01）。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組COL-I、COL-III、TIMP-1的蛋白表達(dá)明顯升高，顯色加深（P<0.01），而MMP-9的蛋白表達(dá)明顯低于正常組（P<0.05）；與模型對(duì)照組比較，HBOA-H組、HBOA-L組COL-I

8、、COL-III、TIMP-1的蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.05或P<0.01），MMP-9的蛋白表達(dá)則明顯升高（P<0.01）。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常組比較，模型對(duì)照組大鼠肝組織中COL-I、COL-III、TNF-α、TGF-β1、ERK1、ERK2 mRNA表達(dá)明顯升高，而PPARγ mRNA的表達(dá)則降低（P＜0.05或 P＜0.01）；與模型對(duì)照組比較，HBOA-H組肝組織COL-I、COL-III、TNF-α、TGF-

9、β1、ERK1、ERK2 mRNA表達(dá)均有降低（P<0.01或P<0.05）；HBOA-L組肝組織COL-I、COL-III、TGF-β1、ERK1、ERK2 mRNA表達(dá)均有降低（P<0.01或P<0.05），TNF-αmRNA表達(dá)水平有所下降，但是未見有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，HBOA-H組和HBOA-L組肝組織PPARγmRNA表達(dá)則明顯升高（P<0.05）。
　　結(jié)論:研究結(jié)果表明，HBOA可調(diào)控MMP-9、TIMP-1、PPARγ和