SiRNA下調(diào)Smad3基因后對(duì)大鼠HSC及大鼠四氯化碳肝纖維化模型的纖維化相關(guān)影響.pdf

1、目的：
　　 (1)肝星狀細(xì)胞的激活是肝纖維化進(jìn)程的關(guān)鍵步驟，而TGF-β/Smads信號(hào)途徑對(duì)肝星狀細(xì)胞的激活尤為重要，Smad3是介導(dǎo)TGF-β信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)傳遞、活化肝星狀細(xì)胞的直接承擔(dān)者，在肝纖維化發(fā)展進(jìn)程中起著關(guān)鍵作用。本文以大鼠Smad3基因?yàn)檠芯繉?duì)象，第一步構(gòu)建并篩選出有效沉默大鼠Smad3基因的干擾載體。
　　 (2)將有效沉默大鼠Smad3基因的干擾載體轉(zhuǎn)染入大鼠星狀細(xì)胞(hepaticsetellate

2、 cells，HSC)HSC-T6中，下調(diào)表達(dá)Smad3基因，阻斷TGF-β/Smads信號(hào)途徑，通過(guò)體外試驗(yàn)觀察對(duì)大鼠HSC的激活的影響，判斷是否有抗纖維化。
　　 (3)將有效沉默大鼠Smad3基因的干擾載體通過(guò)轉(zhuǎn)染入大鼠四氯化碳肝纖維化模型中，探討下調(diào)表達(dá)Smad3基因?qū)Υ笫笏穆然几卫w維化模型中肝纖維化指標(biāo)的影響，從而探索肝纖維化治療的新方法。
　　 (4)利用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的ppGalNAc-T2的siRNA表達(dá)

3、載體，觀察ppGalNAc-T2下調(diào)后對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞TGFβ1-Smad3激活途徑相關(guān)基因表達(dá)的影響，從而初步探討糖基轉(zhuǎn)移酶ppGalNAc-T2對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞的TGFβ1-Smad3信號(hào)激活影響。
　　 方法：
　　 (1)利用互聯(lián)網(wǎng)資源從基因庫(kù)中獲得Smad3基因序列，用ambion公司的siRNA設(shè)計(jì)工具，針對(duì)Smad3基因mRNA序列設(shè)計(jì)三條可能的小干擾RNA(siRNA)，將這三條小干擾RNA插入到RNA干

4、擾載體pRNAT-U6.1/Neo中構(gòu)建成三條干擾載體。將構(gòu)建的3個(gè)帶有熒光標(biāo)記的Smad3干擾載體(pRNAT-siSmad3-1、pRNAT-siSmad3-2、pRNAT-siSmad3-3)并分別轉(zhuǎn)染大鼠肝星狀細(xì)胞株(HSC)中，通過(guò)RT-PCR，Western-Blot的方法篩選出最有效的Smad3基因的siRNA表達(dá)載體。
　　 (2)用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑將最有效的Smad3 siRNA表達(dá)載體(pRNAT-si

5、Smad3-2)轉(zhuǎn)染入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大鼠HSC(1.0μg plasmid/106 cells)中，48小時(shí)后，用trizol提取總RNA，用RT-PCR檢測(cè)下調(diào)Smad3以后對(duì)HSC的Smad2，3，4及膠原Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ mRNA表達(dá)的影響。
　　 (3)80只成年SD大鼠隨機(jī)分成三組，對(duì)照組(30)模型組(30)治療組(20)，模型組和治療組每周兩次皮下注射40％(v/v)四氯化碳橄欖油(3 ml/kg)，共8周。從第四周起用陽(yáng)

6、性脂質(zhì)體將siRNA表達(dá)載體質(zhì)粒(150μg/kg)在全麻，經(jīng)皮下注入模型組大鼠肝右葉中，每?jī)芍芤淮?，而模型組注入相同體積的緩沖劑。于第6、8周末，取得肝組織及血清，觀察用纖維化半定量評(píng)分系統(tǒng)對(duì)病理切片的肝纖維化分級(jí)，及血清相關(guān)指標(biāo)的影響。
　　 (4)在大鼠肝星狀細(xì)胞中轉(zhuǎn)染ppGalNAc-T2的siRNA表達(dá)質(zhì)粒，用RT-PCR檢測(cè)TGFβ1-Smad3信號(hào)途徑相關(guān)基因mRNA的表達(dá)變化，Western blot以及免疫熒光

7、方法檢測(cè)Smad3基因蛋白表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：
　　 (1)成功構(gòu)建到三個(gè)Smad3基因的有效siRNA干擾載體(pRNAT-siSmad3-1、pRNAT-siSmad3-2、pRNAT-siSmad3-3)，并篩選出pRNAT-siSmad3-2為相對(duì)最佳的載體。
　　 (2)轉(zhuǎn)染了pRNAT-siSmad3-2表達(dá)載體的肝星狀細(xì)胞中Smad3和膠原Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ mRNA表達(dá)都受到了明顯抑制。
　　

8、 (3)治療組較模型組，病理切片用纖維化半定量評(píng)分系統(tǒng)觀察到肝纖維化分級(jí)有明顯減輕(P<0.05)，血清肝纖維化指標(biāo)(Ⅲ型前膠原，Ⅳ型膠原，層粘蛋白，透明質(zhì)酸)亦有明顯改善(P<0.01)。
　　 (4)ppGalNAc-T2下調(diào)后肝星狀細(xì)胞中Smad2，Smad3，Smad4，膠原3αI(collagen typeⅢ，alpha1，Col3α1)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β調(diào)節(jié)基因4(transforminggrowth factor b

9、eta regulated gene4，Tbrg4)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforminggrowthfactor beta，TGFβ1)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2(transforming growthfactor beta2，TGFβ2)及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體3(transforming growth factor beta receptor3，Tgfβr3)的mRNA及Smad3的蛋白表達(dá)幾乎沒(méi)有變化(P>0.05)，但轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β

10、受體1(transforming growth factor，beta receptor1，Tgfβr1)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體2(transforming growth factor beta receptor2，Tgfβr2)都有較大程度的降低(P<0.05)
　　 結(jié)論：
　　 (1)轉(zhuǎn)染pRNAT-siSmad3-2載體后，下調(diào)Smad3的表達(dá)，阻斷TGF-β/Smad3信號(hào)途徑，對(duì)大鼠HSC及四氯化碳肝纖維化模型