EV71毒力表型差異與氨基酸突變關系的研究.pdf

1、腸道病毒71型(Enterovirus71, EV71)是引起兒童手足口病(Hand-foot-and-mouth disease, HFMD)的重要病原。感染EV71后大多數(shù)患兒表現(xiàn)的癥狀較為輕微，如手足口部位的皰疹或皰疹性咽峽炎（Herpetic angina，HA）；少數(shù)患兒能夠發(fā)生嚴重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（Central nervous system，CNS）炎癥等并發(fā)癥，如腦炎、腦膜炎、肺水腫甚至死亡。目前EV71感染致使CNS炎癥

2、損傷機制并不完全明確。多數(shù)研究表明，由EV71感染引起臨床癥狀輕重的不同，一方面與被感染者身體免疫水平有關，也與病毒本身毒力強弱有關，即病毒基因組內可能存在毒力相關位點。課題組前期在臨床分離得到6株不同毒力表型的EV71毒株，經(jīng)動物實驗分為強毒株組與弱毒株組，經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)兩組不同毒力的毒株基因組內部發(fā)生了多處核苷酸的變異，并且引發(fā)了編碼區(qū)內8處氨基酸發(fā)生了變化（結構蛋白VP3-I537V，VP1-S639G；非結構蛋白2A-P937 S/

3、C/G，2B-V1014A，2B-I1062T，3C-V1597I，3C-N1617D和3D-V2146A）。為明確病毒毒力的差異是否是由于這些變異位點造成的，并且探明這些突變點與病毒毒力的關系，試驗選取編碼區(qū)內的8處變異位點作為研究對象，在EV71全長cDNA感染性克?。ˋ12質粒）基礎上逐一構建了相應的突變株病毒的感染性克隆并進行了病毒拯救，并對拯救病毒突變前后在細胞上的復制能力作比較。結果發(fā)現(xiàn)位于3C蛋白酶上的nt5591（3C-

4、N69D）位點突變后病毒復制能力明顯降低，甚至無法在RD細胞上進行傳代。為進一步明確nt5591位點變異致使病毒復制及感染能力降低的原因，我們對突變體3C蛋白進行了結構的模擬和分析，發(fā)現(xiàn)突變點臨近酶的活性中心，突變使活性中心的構象發(fā)生變化，可能會對3C蛋白的功能造成影響。為驗證猜想，我們將課題組前期在原核體系中克隆表達的對應nt5591突變點的3C蛋白突變體（3C-N69D），在體外通過酶活實驗與野生株3C蛋白進行了酶活性的比較，結果顯

5、示突變體蛋白3C-N69D與野生3C蛋白相比其活性顯著降低，切割不同底物多肽的能力分別下降了5-10倍。試驗結果表明，nt5591位點的突變造成其所在的3C蛋白酶活性下降，使其剪切病毒多聚蛋白的效率降低，從而抑制了病毒的復制，是造成兩組毒株毒力不同的根本原因。
　　目的：運用反向遺傳學的方法，構建針對編碼區(qū)變異位點的8株EV71突變體感染性克隆并進行病毒拯救，通過比較病毒突變前后復制能力的變化，找出對病毒性狀的改變產(chǎn)生作用的突變點

6、，進而明確這兩組毒力不同的EV71毒株的編碼區(qū)內8處氨基酸的變異是否與病毒復制或毒力有關，并深入探尋變異位點影響病毒復制或毒力的機制。
　　方法：1.在EV71全長cDNA感染性克隆（A12質粒）基礎上，利用Quikchange方法構建針對編碼區(qū)的突變株 cDNA感染性克隆，將其按照在編碼區(qū)的順序依次命名為M1-M8（由重株向輕株進行突變），并進行突變株病毒的拯救，將得到的拯救病毒M1-M8在核酸水平（RT-PCR）和蛋白水平（w

7、estern blot、間接免疫熒光實驗）進行性質檢測，并在RD細胞進行傳代驗證；繪制拯救病毒的生長曲線并分析突變點對病毒復制能力的影響，找出能影響病毒復制的關鍵位點。2.進一步探尋致使M7株突變體病毒復制能力下降的原因。通過生物信息學手段分析突變位點對3C蛋白的影響，設計EV71-3C蛋白酶的多肽底物，通過酶活性實驗檢測突變體3C-N69D的活性變化情況，并結合實驗結果闡述突變與病毒毒力之間的關系。
　　結果：1．成功構建了8株

8、針對編碼區(qū)變異位點的突變體cDNA感染性克隆并在RD細胞上進行拯救嘗試，除M7（突變點nt5591位于3C蛋白酶）和M8（突變點nt7179位于3D蛋白酶）外所有拯救病毒均能穩(wěn)定傳代，生長曲線與未突變前相比無明顯改變；突變株M7和M8轉錄本RNA轉染細胞后雖能表達病毒特異蛋白，但將轉染復合物繼續(xù)傳代后無法在細胞上產(chǎn)生細胞毒性效應（Cytopathogenic effect，CPE），且不能在RD細胞上傳代；M7和M8回復突變驗證結果顯示

9、，M7經(jīng)回復突變后病毒恢復了野生株的生物學性狀，而M8的回復突變體病毒仍不能使細胞產(chǎn)生CPE現(xiàn)象也不能進行傳代。2．通過結構分析可知，突變點緊靠3C蛋白酶活性中心，N69D的突變造成了催化三聯(lián)體的構象發(fā)生改變，可能影響酶的活性；酶活試驗結果顯示，突變體蛋白3C-N69D與野生株3C蛋白相比切割底物的能力下降了5-10倍，酶活性顯著下降。分析得知N69D的突變極有可能是通過抑制3C蛋白酶的活性進而阻礙病毒的復制功能。
　　結論：位于