EV71毒力表型差異與氨基酸突變關(guān)系的研究.pdf

1、腸道病毒71型(Enterovirus71, EV71)是引起兒童手足口病(Hand-foot-and-mouth disease, HFMD)的重要病原。感染EV71后大多數(shù)患兒表現(xiàn)的癥狀較為輕微，如手足口部位的皰疹或皰疹性咽峽炎（Herpetic angina，HA）；少數(shù)患兒能夠發(fā)生嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（Central nervous system，CNS）炎癥等并發(fā)癥，如腦炎、腦膜炎、肺水腫甚至死亡。目前EV71感染致使CNS炎癥

2、損傷機(jī)制并不完全明確。多數(shù)研究表明，由EV71感染引起臨床癥狀輕重的不同，一方面與被感染者身體免疫水平有關(guān)，也與病毒本身毒力強(qiáng)弱有關(guān)，即病毒基因組內(nèi)可能存在毒力相關(guān)位點(diǎn)。課題組前期在臨床分離得到6株不同毒力表型的EV71毒株，經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分為強(qiáng)毒株組與弱毒株組，經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)兩組不同毒力的毒株基因組內(nèi)部發(fā)生了多處核苷酸的變異，并且引發(fā)了編碼區(qū)內(nèi)8處氨基酸發(fā)生了變化（結(jié)構(gòu)蛋白VP3-I537V，VP1-S639G；非結(jié)構(gòu)蛋白2A-P937 S/

3、C/G，2B-V1014A，2B-I1062T，3C-V1597I，3C-N1617D和3D-V2146A）。為明確病毒毒力的差異是否是由于這些變異位點(diǎn)造成的，并且探明這些突變點(diǎn)與病毒毒力的關(guān)系，試驗(yàn)選取編碼區(qū)內(nèi)的8處變異位點(diǎn)作為研究對(duì)象，在EV71全長cDNA感染性克?。ˋ12質(zhì)粒）基礎(chǔ)上逐一構(gòu)建了相應(yīng)的突變株病毒的感染性克隆并進(jìn)行了病毒拯救，并對(duì)拯救病毒突變前后在細(xì)胞上的復(fù)制能力作比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)位于3C蛋白酶上的nt5591（3C-

4、N69D）位點(diǎn)突變后病毒復(fù)制能力明顯降低，甚至無法在RD細(xì)胞上進(jìn)行傳代。為進(jìn)一步明確nt5591位點(diǎn)變異致使病毒復(fù)制及感染能力降低的原因，我們對(duì)突變體3C蛋白進(jìn)行了結(jié)構(gòu)的模擬和分析，發(fā)現(xiàn)突變點(diǎn)臨近酶的活性中心，突變使活性中心的構(gòu)象發(fā)生變化，可能會(huì)對(duì)3C蛋白的功能造成影響。為驗(yàn)證猜想，我們將課題組前期在原核體系中克隆表達(dá)的對(duì)應(yīng)nt5591突變點(diǎn)的3C蛋白突變體（3C-N69D），在體外通過酶活實(shí)驗(yàn)與野生株3C蛋白進(jìn)行了酶活性的比較，結(jié)果顯

5、示突變體蛋白3C-N69D與野生3C蛋白相比其活性顯著降低，切割不同底物多肽的能力分別下降了5-10倍。試驗(yàn)結(jié)果表明，nt5591位點(diǎn)的突變?cè)斐善渌诘?C蛋白酶活性下降，使其剪切病毒多聚蛋白的效率降低，從而抑制了病毒的復(fù)制，是造成兩組毒株毒力不同的根本原因。
　　目的：運(yùn)用反向遺傳學(xué)的方法，構(gòu)建針對(duì)編碼區(qū)變異位點(diǎn)的8株EV71突變體感染性克隆并進(jìn)行病毒拯救，通過比較病毒突變前后復(fù)制能力的變化，找出對(duì)病毒性狀的改變產(chǎn)生作用的突變點(diǎn)

6、，進(jìn)而明確這兩組毒力不同的EV71毒株的編碼區(qū)內(nèi)8處氨基酸的變異是否與病毒復(fù)制或毒力有關(guān)，并深入探尋變異位點(diǎn)影響病毒復(fù)制或毒力的機(jī)制。
　　方法：1.在EV71全長cDNA感染性克?。ˋ12質(zhì)粒）基礎(chǔ)上，利用Quikchange方法構(gòu)建針對(duì)編碼區(qū)的突變株 cDNA感染性克隆，將其按照在編碼區(qū)的順序依次命名為M1-M8（由重株向輕株進(jìn)行突變），并進(jìn)行突變株病毒的拯救，將得到的拯救病毒M1-M8在核酸水平（RT-PCR）和蛋白水平（w

7、estern blot、間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)）進(jìn)行性質(zhì)檢測(cè)，并在RD細(xì)胞進(jìn)行傳代驗(yàn)證；繪制拯救病毒的生長曲線并分析突變點(diǎn)對(duì)病毒復(fù)制能力的影響，找出能影響病毒復(fù)制的關(guān)鍵位點(diǎn)。2.進(jìn)一步探尋致使M7株突變體病毒復(fù)制能力下降的原因。通過生物信息學(xué)手段分析突變位點(diǎn)對(duì)3C蛋白的影響，設(shè)計(jì)EV71-3C蛋白酶的多肽底物，通過酶活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)突變體3C-N69D的活性變化情況，并結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果闡述突變與病毒毒力之間的關(guān)系。
　　結(jié)果：1．成功構(gòu)建了8株

8、針對(duì)編碼區(qū)變異位點(diǎn)的突變體cDNA感染性克隆并在RD細(xì)胞上進(jìn)行拯救嘗試，除M7（突變點(diǎn)nt5591位于3C蛋白酶）和M8（突變點(diǎn)nt7179位于3D蛋白酶）外所有拯救病毒均能穩(wěn)定傳代，生長曲線與未突變前相比無明顯改變；突變株M7和M8轉(zhuǎn)錄本RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后雖能表達(dá)病毒特異蛋白，但將轉(zhuǎn)染復(fù)合物繼續(xù)傳代后無法在細(xì)胞上產(chǎn)生細(xì)胞毒性效應(yīng)（Cytopathogenic effect，CPE），且不能在RD細(xì)胞上傳代；M7和M8回復(fù)突變驗(yàn)證結(jié)果顯示

9、，M7經(jīng)回復(fù)突變后病毒恢復(fù)了野生株的生物學(xué)性狀，而M8的回復(fù)突變體病毒仍不能使細(xì)胞產(chǎn)生CPE現(xiàn)象也不能進(jìn)行傳代。2．通過結(jié)構(gòu)分析可知，突變點(diǎn)緊靠3C蛋白酶活性中心，N69D的突變?cè)斐闪舜呋?lián)體的構(gòu)象發(fā)生改變，可能影響酶的活性；酶活試驗(yàn)結(jié)果顯示，突變體蛋白3C-N69D與野生株3C蛋白相比切割底物的能力下降了5-10倍，酶活性顯著下降。分析得知N69D的突變極有可能是通過抑制3C蛋白酶的活性進(jìn)而阻礙病毒的復(fù)制功能。
　　結(jié)論：位于