EV71調(diào)控N9信號(hào)通路的機(jī)理研究.pdf

1、背景和目的：
　　手足口病是由腸道病毒引起的，以手、足、口出現(xiàn)水皰為特征，多見(jiàn)于5歲以下兒童的傳染病，EV71是引起重癥手足口病的主要病毒之一。它是繼脊髓灰質(zhì)炎病毒后又一嗜神經(jīng)病毒，主要攻擊神經(jīng)元，其感染導(dǎo)致的重癥患者常伴隨神經(jīng)系統(tǒng)的癥狀，如無(wú)菌性腦膜炎、腦干腦炎、脊髓炎、小腦共濟(jì)失調(diào)等。
　　病毒作為嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生生物，在感染的過(guò)程中，受刺激的細(xì)胞會(huì)通過(guò)調(diào)動(dòng)自身的免疫防御系統(tǒng)來(lái)抵御病毒的入侵并實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒的清除。因此，為了

2、進(jìn)行成功的入侵，病毒必須俘獲細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵的信號(hào)通路，以脅迫宿主細(xì)胞為其入侵與增殖服務(wù)。這些信號(hào)通路中研究比較多的就是MAPKs信號(hào)通路和PI3K/Akt通路。信號(hào)通路的功能十分廣泛，能調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖，分化，凋亡等。
　　EV71感染不僅會(huì)伴隨有神經(jīng)系統(tǒng)的癥狀，同時(shí)也會(huì)引起嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。EV71感染的患者腦中有大量IL-6的分泌，且這升高的IL-6能代表IL-1和TNF-a的凈效應(yīng)。
　　關(guān)于EV71病毒感染調(diào)節(jié)信號(hào)通路的研究

3、頗多，EV71感染引起重癥患者多伴隨中樞神經(jīng)系統(tǒng)的癥狀，而小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫細(xì)胞，在被EV71感染后對(duì)信號(hào)通路和細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響尚未報(bào)道，本研究檢測(cè)了EV71感染后對(duì)信號(hào)通路和細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，同時(shí)根據(jù)病毒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，構(gòu)建了11個(gè)重組質(zhì)粒，以探究病毒感染調(diào)控的信號(hào)通路是否由單個(gè)病毒蛋白所介導(dǎo)。
　　方法：
　　1. EV71病毒擴(kuò)增，TCID50方法檢測(cè)滴度后感染小膠質(zhì)細(xì)胞
　　2.研究病毒感染后對(duì)信號(hào)通

4、路的影響：分不同的時(shí)間點(diǎn)（30 min,2 h,4 h,6 h,8 h,12 h,24 h）收取病毒感染后SDS裂解液裂解的細(xì)胞蛋白，用western blot檢測(cè)病毒感染后對(duì)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)
　　3.檢測(cè)細(xì)胞因子IL-6和病毒的復(fù)制情況：分兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)（12 h和24 h）收取先經(jīng)相應(yīng)信號(hào)通路的抑制劑處理再病毒感染的培養(yǎng)上清，一部分根據(jù)EV71的通用引物用real-time PCR檢測(cè)病毒的滴度，另一部分用ELISA檢測(cè)IL-6的產(chǎn)

5、生。
　　4.明確EV71的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，將其11個(gè)片段分別克隆出來(lái)，并構(gòu)建出11個(gè)重組質(zhì)粒。
　　5.探討單個(gè)病毒蛋白與被調(diào)控信號(hào)通路的關(guān)系：分別將這11個(gè)重組載體轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，以探究病毒感染調(diào)控的信號(hào)通路是否由單個(gè)病毒蛋白所介導(dǎo)。
　　結(jié)果：
　　1. EV71感染小膠質(zhì)細(xì)胞N9激活ERK1/2和p38信號(hào)通路，細(xì)胞因子IL-6的產(chǎn)生增加；在小膠質(zhì)細(xì)胞BV2中則是抑制PI3K/Akt通路。
　　2.確認(rèn)ER

6、K1/2的抑制劑U0126和p38的抑制劑SB203580能抑制ERK1/2和p38信號(hào)通路的激活。
　　3.在EV71感染的N9細(xì)胞系中，細(xì)胞因子IL-6的產(chǎn)生增加，當(dāng)分別使用ERK1/2和p38的抑制劑U0126和SB203580抑制ERK1/2和p38信號(hào)通路的激活時(shí)，升高的IL-6分泌量均下降，且p38的下降量更明顯。同時(shí)檢測(cè)到抑制p38信號(hào)通路使病毒的復(fù)制也受到抑制。
　　4.表達(dá)單個(gè)病毒蛋白的細(xì)胞未檢測(cè)到類(lèi)似病毒

7、感染所調(diào)控的信號(hào)通路的變化。
　　結(jié)論：
　　在小膠質(zhì)細(xì)胞系N9，EV71病毒感染激活ERK1/2和p38信號(hào)通路，提高細(xì)胞因子IL-6的產(chǎn)生，當(dāng)ERK1/2和p38的激活分別被抑制劑U0126（ERK1/2）和SB203580（p38）阻斷時(shí)，結(jié)果顯示ERK1/2和p38信號(hào)通路在細(xì)胞因子IL-6的產(chǎn)生和病毒復(fù)制中發(fā)揮著重要作用，阻斷通路的激活減少了IL-6的分泌和病毒的復(fù)制。且較ERK1/2通路而言，p38通路在炎癥因子