模擬微重力下的血清miRNAs研究.pdf

1、長(zhǎng)期空間飛行過(guò)程中，由于重力的消失迫使機(jī)體的多種組織和器官去適應(yīng)新的微重力環(huán)境，從而產(chǎn)生一系列的適應(yīng)性變化，稱(chēng)之為“空間適應(yīng)綜合癥”。這些航天醫(yī)學(xué)問(wèn)題已成為人類(lèi)長(zhǎng)期太空探索的重要障礙之一，主要包括骨丟失、認(rèn)知功能損傷、肌肉萎縮、心血管功能紊亂等。
　　航天微重力環(huán)境對(duì)航天員的生理健康和任務(wù)執(zhí)行造成了嚴(yán)重影響，如何對(duì)這些影響進(jìn)行監(jiān)測(cè)和防護(hù)并揭示其機(jī)制，是航天醫(yī)學(xué)研究的首要任務(wù)。開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單有效的檢測(cè)指標(biāo)對(duì)于航天員的生理健康監(jiān)測(cè)具有重要意

2、義。同時(shí)，以系統(tǒng)生物學(xué)的思維來(lái)探索微重力對(duì)機(jī)體動(dòng)態(tài)的、全身性的影響，將是航天醫(yī)學(xué)問(wèn)題研究的有效手段。本論文以尾吊大鼠作為主要的動(dòng)物模型，通過(guò)對(duì)血清miRNAs表達(dá)譜的研究來(lái)探索模擬微重力對(duì)機(jī)體的影響，獲得以下主要結(jié)果:
　　首先對(duì)血清miRNAs的內(nèi)參基因進(jìn)行了篩選和驗(yàn)證。通過(guò)miRNAs芯片篩選，并結(jié)合多批次、大樣本的qPCR及2個(gè)專(zhuān)業(yè)內(nèi)參篩選軟件(geNorm和Normfinder)的運(yùn)算分析，確定了miR-25-3p是最穩(wěn)定

3、的內(nèi)參基因。進(jìn)一步分析表明，miR-25-3p是一個(gè)在不同物種間高度保守的基因。它在大鼠尾吊、獼猴臥床等模擬微重力模型，以及大鼠OVX、絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松等模型中的表達(dá)均有很好的穩(wěn)定性，從而最終確定miR-25-3p可作為這些模型中穩(wěn)定的血清miRNAs內(nèi)參基因。這些結(jié)果為后續(xù)開(kāi)展的的血清miRNAs研究奠定了基礎(chǔ)。
　　隨后我們對(duì)失重性骨丟失和絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的血清miRNAs標(biāo)志物進(jìn)行了篩選。利用大鼠OVX血清miRNAs芯片技術(shù)高

4、通量篩選差異表達(dá)的miRNAs，并經(jīng)qPCR驗(yàn)證得到15個(gè)下調(diào)的miRNA。進(jìn)一步結(jié)合臨床樣本檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，其中miR-30b-5p在骨質(zhì)減少和骨質(zhì)疏松病人血清中都顯著下調(diào)，miR-103-3p、miR-142-3p和miR-328-3p在骨質(zhì)疏松病人血清中顯著下調(diào)。偏相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)它們與H-BMD之間均存在顯著的正相關(guān)，而且miR-30b-5p和miR-142-3p還同時(shí)與FN-BMD顯著相關(guān)。這4個(gè)miRNAs可作為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的生物

5、標(biāo)志物。利用獼猴臥床實(shí)驗(yàn)對(duì)模擬失重性骨丟失的標(biāo)志物進(jìn)行了鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-30b-5p、miR-103-3p和miR-142-3p在臥床后獼猴血清中的表達(dá)顯著下降，ROC曲線分析表明它們有很好的診斷價(jià)值，但miR-328-3p未發(fā)生顯著變化。從而確定miR-30b-5p、miR-103-3p和miR-142-3p可作為模擬失重性骨丟失的標(biāo)志物。
　　miRNA表達(dá)譜和代謝組學(xué)數(shù)據(jù)都包含了生理變化的重要信息，為了對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行深度挖

6、掘，我們進(jìn)行了二者的聯(lián)合分析。血清miRNAs芯片和qPCR檢測(cè)確定了13個(gè)在尾吊4周和5周后大鼠血清中均上調(diào)的miRNAs，pather和DAVID軟件的分析表明它們與神經(jīng)系統(tǒng)，尤其是海馬高度相關(guān)。連續(xù)尾吊5周后，血清代謝組發(fā)生顯著性變化，與變化miRNAs的預(yù)測(cè)靶基因進(jìn)行聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，模擬失重對(duì)機(jī)體的神經(jīng)系統(tǒng)尤其是海馬區(qū)有顯著影響。
　　根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果，我們檢測(cè)了尾吊大鼠海馬組織miRNA、mRNA和蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)m

7、iR-383-5p的表達(dá)顯著上調(diào)，同時(shí)其預(yù)測(cè)靶基因AQP4的mRNA和蛋白水平均顯著下調(diào)，推測(cè)它可能直接受miR-383-5p的靶向調(diào)控。通過(guò)體外雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，確認(rèn)了AQP4是miR-383-5p的靶基因。AQP4是調(diào)節(jié)腦組織水平衡的重要蛋白，也與海馬的學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知功能密切相關(guān)。因此，推測(cè)它的變化是微重力影響海馬功能的潛在機(jī)制之一，并可能與微重力下的血液頭向分布相關(guān)。
　　綜上所述，我們通過(guò)對(duì)血清miRNAs的研究發(fā)現(xiàn)